荠菜多糖的分离纯化与单糖组成分析

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(1.南华大学附属第一医院药剂科，湖南 衡阳 421001；2.南华大学药物药理研究所)

·技术与方法·

荠菜多糖的分离纯化与单糖组成分析

王华1，熊淑娟2，曹轩2，陈临溪2，唐国涛2

(1.南华大学附属第一医院药剂科，湖南 衡阳 421001；2.南华大学药物药理研究所)

目的对荠菜多糖进行分离纯化并分析其单糖组成。方法采用超声法提取总多糖，除蛋白，用SephadexG-75进行纯化，水解后用气相色谱分析其单糖组成。结果分离得到两个多糖组分1和2。气相色谱鉴定出其中四种单糖组成，D-木糖、L-鼠李糖、D-甘露醇和D-葡萄糖，其组成比例为1:1.8:270.8:1。结论从荠菜多糖中分离出两种多糖组分，组分2由8种多糖组成，鉴定出其中4种。

荠菜多糖； 分离纯化； 单糖组成； 气相色谱

荠菜(Shepherdspurse Herb)，始载于《千金食治》为十字花科植物荠菜的带根全草。荠菜为药食同源植物，江南有三月三吃荠菜的习俗。荠菜的药用价值很高，全株入药，具有明目、清凉、解热、利尿、治痢等药效，其花与籽可以止血[1,3]。荠菜多糖是荠菜的主要有效成分之一，多糖具有多种生物功能，如增强机体免疫功能、抗肿瘤、抗病毒、降血糖等[4]。荠菜多糖对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌有一定的抑制作用[5]，另外具有一定的清除氧自由基的作用[6]。

对荠菜多糖的成分分析，还未见文献报道。本试验对荠菜多糖进行了分离纯化，通过气相色谱法对照已知单糖气相色谱峰确定多糖中单糖的组分，并计算其摩尔比，为荠菜多糖的合理开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂

标准单糖(科密欧、Blosharp、aladdin公司)，4 mol/L三氟乙酸，甲醇，氢氧化钠，硼氢化钠，三甲基氯硅烷，六甲基二硅醚烷，吡啶，分子筛。所用试剂皆为分析纯。

1.2 实验仪器

安剖瓶，氮吹仪，恒温水浴箱，HP-5石英毛细管色谱柱，超低温冷冻储存箱(中科美菱)；AR2140型电子分析天平(上海奥豪斯仪器有限公司)；6890N Network GC System气相色谱仪(美国Agilent 公司)；TD25型低速离心机(沙平凡仪器仪表有限公司)；XMTD-8222型真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；FD-1B-50型冷冻干燥机(京博医康实验仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 多糖的提取 称取荠菜药材粉末30 g，加4倍量95%乙醇回流提取脱脂，药渣加300 mL蒸馏水超声1 h，过滤，离心，取上清液，得粗多糖提取液。

1.2.2 多糖的纯化 多糖提取液通过木瓜蛋白酶法脱蛋白[7]，透析，离心，上清液加入乙醇使之体积分数达到90%，离心得沉淀，沉淀用水配制成浓度为5%的多糖溶液，离心，上清液用Sephadex G-75层析柱分离( 2.6 mm× 40 cm)，用双蒸水进行洗脱，洗脱液用自动收集仪收集( 每管4 mL)，分别收集洗脱液，透析，冻干，计算产率。

1.2.3 多糖的成分测定 (1)多糖的水解：1 mg的多糖样品(组分2)溶解在2 mL的4 mol/L的TFA溶液中，充氮气加盖密封，置100 ℃水解6 h。然后用氮气除水。(2)单糖的还原：水解糖样品溶解在0.5 mL的0.05 mol/L氢氧化钠溶液中，加入10 mg的硼氢化钠，在60 ℃还原1 h。加乙酸至无气泡逸出为止。用氮气除去水，加入1 mL甲醇并振荡溶解后，用氮气除去甲醇。这样反复5次以除去硼酸根。残渣在冷冻干燥机中干燥6 h[8]。(3)单糖的甲基化：干燥物加入1 mL 4A分子筛干燥的吡啶，振荡使其溶解，再依次加入0.5 mL六甲基二硅醚烷和0.2 mL的三甲基氯硅烷，振荡，混合均匀，置于4 ℃冰箱中反应12 h，使其充分反应，完全衍生成糖的三甲基硅醚衍生物。离心机离心8 min(4 000 r/min)，取上清液，进行GC分析。(4)气相色谱分析：气相色谱条件为：HP-5石英毛细管色谱柱(50 m×0.22 mm，0.25 μm)；EI源，电子能量70 eV，分子量扫描范围33～550，柱箱温度130～290 ℃，每分钟升高10 ℃，进样口温度295 ℃，载气氮气流速1.2 mL/min，分流比50∶1，检测器温度300 ℃。在此方法下对各糖样进行检测并得到相关的气相色谱图。

3 结 果

3.1 多糖组分的分离

经过柱层析，自动收集仪收集(每管4 mL)，苯酚—硫酸法显色，以洗脱管数-吸光度值( A) 绘制洗脱曲线( 见图1) 。根据曲线，分别收集洗脱液，透析，冻干，得到多糖组分1和2，从图中可以看出荠菜多糖明显分为2个洗脱峰，之后趋于平缓，说明多糖已完全洗脱下来，两个峰对称性较好，说明其均一性较好，可能为均一多糖。共含量分别为1.83%和5.62%。

图1 荠菜多糖经Sephadex G-75层析柱洗胶曲线

3.2 单糖组成的测定

取9种单糖对照品10 mg，按上述方法甲基化，得到的反应产物可直接进样分析，结果见表1。表中保留时间是鉴定单糖种类的主要标准，峰面积[S]用来计算单糖含量。从表1中可知，几种主要单糖的保留时间相对集中，时间段为8～11分钟，在该段时间内出现的为各单糖的特征峰。本次实验中D-果糖和D-山梨醇存在两组数据，其余单糖均有一组数据。

将标准单糖混合后进行气相分析，所得结果见图2。数据见表2。

将荠菜多糖水解甲基化后进行气相分析，所得结果见图3。数据见表3。

3.3 结果分析

将标准糖与荠菜多糖的气相图谱与数据进行对比析，可分析出荠菜多糖的水解产物中含有四种已知的单糖成分，这四种单糖分别为D-木糖，L-鼠李糖，D-甘露醇，D-葡萄糖。分别对应图中的四个峰值，其一一对应关系见表4。

表1单个标准糖样气相色谱数据

单糖名称保留时间[min]峰宽[min]峰面积[PA*S]峰高[PA]峰面积[S]D-阿拉伯糖8.4580.03813178.113192.406D-半乳糖10.6670.04273437.154791156.756711.69781D-甘露糖10.5070.0470926.09692291.934570.65494D-果糖10.5220.0669526.76135108.098040.0942210.5960.0344163.452621035.01340.02924D-木糖8.3530.04106491.192382294.647711.80188D-葡萄糖10.6100.04231501.07361541.765440.83070D-山梨醇10.5130.0724801.91815154.791900.5788810.5970.0363451.48413200.355740.32591L-鼠李糖8.9480.03844915.950681883.888181.60942甘露醇10.5310.31159209.92578358.730161.69172

图2 标准单糖混合液气相色谱

表2单个标准糖混合后的气相色谱数据

出峰顺序保留时间类型峰宽[min]峰面积[PA*S]峰高[PA]峰面积18.306BV0.0388425.62576172.288450.0530328.426VV0.05071063.27002290.590450.1324738.751BV0.045563.9558121.030360.0079748.997VV0.1335319.0282330.640820.03975510.098VV0.0823213.1542738.663860.02656610.389VV0.0691326.2425566.619970.04064710.542VBAS0.16552965.21509231.442630.36942

图3 荠菜多糖气相色谱

表3荠菜多糖气相色谱数据

出峰顺序保留时间类型峰宽[min]峰面积[PA*S]峰高[PA]峰面积18.365BB0.03493.698311.730640.0013628.848BV0.05506.020341.495080.0022238.948VV0.09736.555461.043320.0024249.053VB0.08567.579981.169950.0027959.880BV0.303698.939483.932070.03646610.527VBAS1.09151138.8972212.285700.41971710.790BVT0.06126.606161.705660.00243811.308VVT0.03752.795331.105040.00103

表4荠菜多糖分析出4种单糖组成及摩尔比值

单糖成分出峰顺序摩尔数(μmol)比例D-木糖10.054821.0L-鼠李糖30.099841.8D-甘露醇614.84465270.8D-葡萄糖70.057281.0

4 讨 论

多糖的提取有多种方法[9]，有水提，碱水提取，单一或复合酶提取，超声波提取，双水相萃取，微波辅助提取等多种提取方法。本实验采超声波提取法，提取效率高，时间短[10]。多糖除蛋白的方法选择木瓜蛋白酶除蛋白，其蛋白去除率及多糖保留率较高[7]。多糖的结构分析手段很多，主要分为两大类，即化学分析法和物理分析法，本实验主要采用气相色谱分析了荠菜多糖的单糖组成，由于标准单糖的样品有限，我们只做了常见九种标准单糖，荠菜多糖的GC色谱图上有8个峰，但对应上的只有4种单糖，还有4个峰没有找到对应的标准单糖，我们在对多糖进行提取研究过程中，发现荠菜多糖在碱性条件下在水中会析出，而在酸性条件下溶解，我们认为可能其含有带碱性的基团，但从分析出的4种糖中，未发现有带碱性的基团。其余的几种单糖组成需用更多的标准糖进行对比分析。多糖的大小，连接的位置等还有待通过核磁共振，质谱等做进一步研究。

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Isolation,PurificationandMonosaccharideCompositionAnalysisofPolysaccharidefromShepherdspurseHerb

WANG Hua,XIONG Shujuan,CAO Xuan,et al

(TheFirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

Objectiveto isolate and purify the polysaccharide and analyze the monosaccharide composition.Methodsthe polysaccharide extraction removing the proteins were purified through sephadex G75,the polysaccharide components were analyzed by gas chromatography(GC) after hydrolization.Relsultstwo monosaccharide components were obtained after purification.Four monosaccharide compositions concluding D-xylose,L-rhamnose,D-mannose and D-glucose were measured by GC in the second components and the proportion were 1∶1.8∶270.8∶1.Conclusiontwo polysaccharide fractions were isolated from Shepherdspurse Herb.The second fraction was composed of eight kinds of monosaccharide and four of them were identified.

Polysaccharide of Shepherdspurse Herb; isolation and purification; monosaccharide compositions; gas chromatography(GC)

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.01.021

2014-01-22；

2014-09-19

基金项目：湖南省中医药科研计划项目(201162)

*通讯作者，E-mail:tqtzq@163.com

R917

A

(此文编辑：秦旭平)