细菌sRNA与抗菌药物的药理作用及耐药性

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(中南大学药学院药理学系，湖南 长沙 410078)

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细菌sRNA与抗菌药物的药理作用及耐药性

张旺，李元建*

(中南大学药学院药理学系，湖南 长沙 410078)

sRNA； 抗菌作用； 耐药性

非编码微小RNA即microRNA在细胞生长、增殖、分化、凋亡等生命过程中起重要的调控作用，几乎参与所有疾病的病理生理过程，为近年研究的热点课题。原核细胞也存在非编码RNA，称为小RNA(small non-coding RNA，sRNA)。sRNA作为一种应答元件，通过与靶mRNA碱基互补配对抑制靶基因mRNA翻译或(和)降解mRNA，在转录后水平调控细菌多种功能，影响细菌生长与繁殖[1,2]。虽然sRNA的发现(1967年)早于microRNA(1993年)，但其功能研究却晚于后者。新近研究发现，细菌sRNA与抗菌药物的作用和耐药性密切相关。

1 sRNA的生物学特性

sRNA是一类广泛存在于原核生物，长度为50～300 nt的核苷酸。自1967年从大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)中分离出第一个sRNA(6SRNA)以来[3]，经过半个世纪的研究，该细菌中已发现约100种sRNA[4]，随后的研究证明其他细菌如沙门氏菌(salmonella)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，P.aeruginosa)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，L.monocytogenes)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)等同样存在sRNA[5-11]。

细菌sRNA的编码区主要位于基因间区(intergenic region，IGR)，某些位于编码基因5′和3′非翻译区(untranslated regions，UTR)[12]。根据sRNA的调节作用不同可将sRNA分为4类：调节蛋白活性sRNA，顺式非编码sRNA(cis-encoded sRNA)，反式非编码sRNA(trans-coded sRNA)和规律成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs)[8,13,14]。目前研究较多的为顺式非编码sRNA和反式非编码sRNA，其中顺式非编码sRNA由靶mRNA的反义链编码，存在一段序列与靶mRNA完全互补配对(配对碱基通常大于75 nt)，具有高特异性、高亲和力的特点，而反式非编码sRNA其编码基因与靶mRNA相距较远[10,13,14]。原核生物中的sRNA作用方式类似于真核生物microRNA，通过不完全互补配对降解mRNA或(和)抑制mRNA的翻译[10,13,14]，从而参与调节细菌的生长、繁殖。然而，细菌sRNA的结构、功能及作用机制与真核生物miRNA不完全相同(表1)。

表1真核生物miRNA与细菌sRNA的比较

真核生物microRNA细菌sRNA参考文献长度19～25nt50～500nt来源多以茎环结构存在于较长的RNA转录产物中,经胞液中Dicer核酸酶剪切转录始于一段能折叠成稳定茎环结构的序列,终止于不依赖Rho的转录终止子15～18结构前体茎环剪切加工而来具有稳定的茎环结构,不需要加工16,17,19分类顺式非编码RNA,反式非编码RNA多为反式非编码RNA,少数为顺式非编码RNA13,14作用机制形成核糖核蛋白体与靶mRNA配对,抑制mR-NA的翻译,促进降解Hfq协助下与靶mRNA配对,抑制mRNA的翻译,促进降解13～16,19,20生物学功能真核生物转录后基因调控,在细胞自身及细胞间发挥调节作用,几乎参与所有病理生理过程原核生物转录后基因调控,调节细菌多种生理过程及应激反应14,21～24

研究发现，细菌sRNA的主要生物学功能之一是感应外界环境刺激，通过调控细胞代谢及应激反应以适应环境变化。例如，鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii，A.baumannii)对温度和渗透压刺激的反应可能受AbsR25调节[25]，而大肠杆菌对低温(低于25℃)刺激的反应则通过反式非编码的sRNA DsrA所调节[26]；在ryhB基因敲除的伤寒沙门菌(Salmonella Typhimurium，S.Typhimurium)，H2O2诱导的氧化应激显著增强，并证明OxyR能直接与ryhB相互作用，从而调节ryhB的表达[27]。有趣的是，sRNA还能参与抗菌药物的作用，并与细菌的耐药性密切相关，如阿奇霉素(2 μg/mL)能直接和间接抑制铜绿假单胞菌rsmY/Z的表达，阻断细菌的群体感应及生物被膜的形成[28]；鲍曼不动杆菌AbsR25能调节药物外流蛋白编码基因的表达[25]。

2 sRNA介导抗菌药物的杀菌作用

抗菌药物可特异性地干扰细菌的生长代谢过程(包括阻断DNA复制和RNA合成，抑制蛋白合成与代谢酶活性)，破坏其结构与功能，产生杀菌或抑菌效应。基于sRNA对细菌生长与繁殖起重要的调控作用，人们推测sRNA可能是寻找抗菌药物的新靶点。研究发现，洋葱伯克霍尔德杆菌(Burkholderia cenocepacia，B.cenocepacia)sRNA mtvR过表达能显著降低阿米卡星和庆大霉素的最小抑菌浓度(分别降低了7倍和4倍)以及显著提高β-内酰胺类抗生素(头孢他啶和亚胺培南)的敏感性(分别提高了3倍和4倍)[29]。大肠杆菌sRNA ryhB能促进CirA表达，后者与其配体大肠菌素Ia结合诱导靶细胞死亡；研究发现，ryhB及cirA缺失突变菌株，大肠菌素Ia处理诱导细菌死亡的作用被取消[30]。在金黄色葡萄球菌，sRNA SprX过表达显著提高金黄色葡萄球菌对糖肽类抗生素的敏感性，其机制是通过L3环调节第V阶段产孢蛋白G(stage V sporulation protein G，SpoVG)而发挥作用[31]。阿奇霉素(2 μg/mL)能直接和间接抑制铜绿假单胞菌rsmY/Z的表达，阻断细菌的群体感应及生物被膜的形成，可能是该药的杀菌机制之一[29]。上述研究表明，某些抗菌药物通过影响细菌sRNA的表达而调控相关基因的表达，从而提高细菌对药物的敏感性，发挥抗菌作用。sRNA介导抗菌药物的作用加深了对某些药物作用机制的认识，并为寻找抗菌药物提供新思路。例如，主要影响蛋白质合成的阿奇霉素也能下调sRNA(RsmY/Z)的表达而损伤细胞膜的功能[29]。已知多种杀菌药物(氨苄西林，卡那霉素，诺氟沙星及万古霉素)杀菌机制涉及氧化应激反应[32]，但其确切机制尚未明了。鼠伤寒沙门菌(Salmonella enterica sv.Typhimurium)sRNA ryhB-1和ryhB-2缺失可导致细菌内活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平增加[27]。治疗伤寒的氨苄西林等药物诱导氧化应激是否通过影响sRNA表达而发挥作用有待研究。抗菌药物依据作用机制不同分为干扰细菌细胞壁的合成，改变细胞膜通透性，抑制蛋白合成，影响核酸及叶酸代谢5大类，sRNA是否独立于上述抗菌药物的作用机制，以及与这些抗菌机制的关系值得研究。

许多抗菌药物如抗生素为细菌的二级代谢产物，约2/3的天然抗生素从天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor，S.coelicolor)中获得。另一方面，某些细菌的二级代谢产物能杀灭与其寄生于同一宿主的其他细菌，例如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens，P.fluorescens)能分泌氰化氢、AprA外切蛋白酶和2,4-二乙酰基间苯三酚，这些二级代谢产物能杀灭寄生于同一植物根际的真菌。sRNA能调控二级代谢产物的表达，可能是寻找抗菌药物的新途径。例如，在天蓝色链霉菌过表达sRNA scr239和cnc2189.1可显著减少二级代谢抗生素放线紫红素的生成，而敲除菌株中生成则增加[33]。三羧酸循环的中间产物能有效调节荧光假单胞菌GacS-GacA二元信号系统依赖的sRNA(RsmX、RsmY和RsmZ)，进而调节二级代谢产物的生成和抗菌活性[34]。

3 sRNA与细菌耐药性

无论是真核细胞还是原核细胞，对外界刺激产生适应性变化是其固有特性，而sRNA在调节细菌适应性中起重要作用。细菌耐药性是细菌对抗菌药物的自然反应，长时间高浓度接触抗菌药物，细菌可通过改变自身结构或状态(改变药物作用靶位结构，影响生物被膜通透性及提高药物转运蛋白活性)产生获得性耐药。sRNA作为细菌广泛存在的调节元件，调节细菌对抗生素的适应性而介导细菌耐药。Jing Y,等[6]首次报道了抗菌药物对细菌sRNA表达的影响，基因芯片结果显示，利奈唑胺等四种药物处理多重耐药金黄色葡萄球菌(Multidrug-Resistant Staphylococcus aureus，MRSA)后，39个sRNA表达变化显著。其他学者也证明多种抗菌药物的耐药性与sRNA表达变化有关，如替加环素处理诱导伤寒沙门菌sRNA表达，其中sYJ20可能参与伤寒沙门菌对替加环素的耐药[5]；生物信息学预测，鲍曼不动杆菌sRNA AbsR25的靶基因中有3个与药物转运相关[25]。在大肠杆菌中，sRNA ralR及其靶基因ralA双缺失突变菌株对磷霉素的敏感性显著高于野生型菌株[35]；两性霉素B的耐药涉及PhoP/PhoQ二元信号系统，后者通过sRNA mgrR负性调节耐药相关基因eptB[36]；氨苄西林诱导sRNA sdsR的表达，后者与DNA错配修复基因mutS碱基互补配对而抑制细菌的错配修复，从而导致大肠杆菌耐药[37]。然而，sRNA调控某些细菌耐药的确切机制尚未完全阐明，且与已知的耐药机制之间的关系也尚待研究。

4 结 语

新近研究表明细菌sRNA不但在细菌的生长、繁殖等生物学过程中发挥重要作用，也介导了抗菌药物的杀菌作用，这为进一步研究抗菌药物的作用机制及寻找抗菌新药提供了思路。另一方面，sRNA在细菌对外界适应性变化中起重要调节作用，为阐明细菌耐药性提供了新的解释。然而，有关sRNA介导抗菌药物的作用及耐药性的研究目前仍处于起步阶段，还有许多问题有待深入探讨：① sRNA介导抗菌药物的作用及细菌耐药机制尚未完全阐明，包括sRNA的种类及其上、下游的调控机制；② sRNA的生物学效应依赖于分子伴侣Hfq，sRNA与Hfq相互作用的认识还有存在争议，Hfq能促进sRNA与靶mRNA的结合并形成稳定sRNA-mRNA复合物，另有学者认为，Hfq能与sRNA竞争结合靶mRNA而抑制靶mRNA的表达和翻译[30]，阐明两者相互作用有助于认识sRNA的作用机制；③已知真核细胞能主动分泌miRNA，发挥临近细胞与远程调节作用[22]。细菌也能分泌sRNA[38,39]，但分泌型sRNA的生物学意义尚不清楚。随着研究的深入，对sRNA的生物学及药理学的认识必将获得更大进步。

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10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.01.001

2014-08-26；

2014-09-20

国家自然科学基金(81273513).

*通讯作者，E-mail：yuan_jianli@yahoo.com.

李元建 教授

专家简介： 李元建，男，药理学教授，博士生导师。享受政府特殊津贴，卫生部有突出贡献的中青年专家。兼任湖南省心血管研究重点实验室主任。《国际病理科学与临床杂志》主编，《中国药理学与毒理学杂志》、《中国动脉硬化杂志》、《中南大学学报—医学版》等杂志编委。主编与参编教材或专著11部。先后获卫生部青年科研基金、美国心脏学会博士后资助、教育部优秀年轻教师基金及重点跟踪资助、教育部跨世纪优秀人才培养计划基金、教育部重大项目、国家自然科学基金面上与重点项目、973项目子课题、湖南省自然科学基金、湖南省重点实验室基金等20余项基金。科研方向为心血管药理，主要研究内容为心血管新药研发及药物作用机制。先后获省部级科研成果16项。指导的研究生获全国博士论文奖1人，全国优秀博士论文提名奖5人。发表科研论文260余篇，其中被SCI收录论文210篇。

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(此文编辑：秦旭平)