玫瑰花苞抗自由基能力的检测

樊琛，胥慧贞，刘桂芹，曾庆华，李燕，孙小凡

（聊城大学农学院，山东聊城252059）

玫瑰花苞抗自由基能力的检测

樊琛，胥慧贞，刘桂芹，曾庆华，李燕，孙小凡

（聊城大学农学院，山东聊城252059）

对玫瑰花苞抗多种自由基能力进行检测。通过正交试验分析溶剂浓度、料液比、处理时间以及提取温度等对玫瑰花苞提取物清除自由基能力的影响。结果表明玫瑰花苞浸出液对DPPH·（2，2-二苯代苦味酰基苯肼）、ABTS+·（2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐）的清除率可达90%以上，对超氧阴离子自由基（O2-·）的清除率随处理条件变化明显，对羟基自由基（·OH）的清除率低于10%。对4种自由基的清除能力从大到小依次为：ABTS+·、DPPH·、O2-·、·OH。玫瑰花苞提取物对各种自由基具有清除能力。

玫瑰花苞；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基；2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）自由基

玫瑰具有强肝养胃、活血调经、润肠通便、解郁安神、消炎杀菌、消除疲劳、改善体质、润泽肌肤的功效。近年来，对玫瑰花中生物活性物质的研究较多，研究发现其具有抗突变、抗肿瘤、抑制高血压和抑菌功能[1-3]。

本研究以玫瑰花苞为原料，运用正交试验法，以料液比、提取时间、乙醇浓度、提取温度为因素，提取玫瑰花苞中总抗氧化成分，为玫瑰花苞的综合利用提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玫瑰花苞：北京同仁堂健康药业（福州）有限公司，无腐烂、无虫蛀。

乙醇、NaNO2、水杨酸、H2O2、FeSO4、三羟基甲基氨基甲烷（Tris）、邻苯三酚、HCl均为分析纯；芦丁、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：sigma公司；2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）：生工生物工程（上海）有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-1700紫外可见分光光度计：日本岛津公司；SK1200H超声清洗机：上海科导超声仪器有限公司；79-2双向磁力加热搅拌器：江苏省金坛市医疗仪器厂；SB-2000水浴锅：上海爱朗仪器有限公司；TD5台式多管架离心机：长沙英泰仪器有限公司。

1.3.1 样品处理

称取干玫瑰花苞样本，用研钵研成粉末，悬于溶剂中，超声处理浸提后抽滤，滤液于3 000 r/min离心15min后，置于冰箱中保藏，备用。

1.3.2 浸提液乙醇浓度筛选

料液比1∶200，超声浸提15min，乙醇浓度分别为0%、25%、50%、无水乙醇。通过羟自由基和超氧自由基清除率筛选乙醇浓度。

1.3.3 正交试验的设计

依据单因素预试验的结果及文献资料，选取四因素三水平条件，分别为：料液比、提取时间、溶剂（乙醇）浓度、提取温度。其中，料液比（g/mL）为1∶100、1∶150、1∶200，提取（超声处理45W）时间为15、30、45min，乙醇浓度为20%、35%、50%，提取温度为20、40、60℃。按上述条件选取L9（34）正交表，如表1。

设f(x)为定义在m+1个节点a=x0＜x1＜…＜xm=b上的离散函数，即 f(x)完全由函数表(xj,f(xj)),j=0,1,···,m所确定。表1中xj为 4X1 DS18B20矩阵测量的温度值，yj为精创仪器仪表厂生产的水银温度计测量的温度，精度为0.01℃。

以提取物清除自由基（HO·、O2-·、ABTS+·、DPPH·）效率为考量指标，确定最佳料液比、处理时间、浸提溶剂的浓度、提取温度等工艺条件。

表1 正交试验设计表Table1 O r thogonal Test

1.3.4 体外抗自由基试验

1.3.4.1 清除HO·能力的测定[4-6]

采用Fenton反应体系法，2mL 1.96mmol/LH2O2，2mL 1.8mmol/LFeSO4和2mL 1.8mmol/L水杨酸-乙醇，0.1mL样品溶液。其中，H2O2最后加入并启动整个反应。反应体系37℃反应30min，以蒸馏水为参比，在510 nm处测量溶液的吸光度值。以蒸馏水代替样品溶液作空白对照。每个试样作3个平行，取其平均值。根据下式计算HO·清除率：

式中：A0为空白对照组的吸光度；AX为加入样品溶液后的吸光度；A1为不加显色剂H2O2样品溶液本底的吸光度值。

1.3.4.2 清除O2-·能力的测定[7-9]

采用邻苯三酚自氧化法。取1mmol/L的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液（pH8.2）4.5m L，置25℃水浴中预热20min后，分别加入1mL试样溶液和0.4mL 5mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴中反应5min，加入1.6mmol/LHCl1mL终止反应，用紫外-可见分光光度计在波长325 nm处测定溶液的吸光度（AX）。空白对照组以相同体积的蒸馏水代替样品溶液，用紫外-可见分光光度计在波长325 nm处测定溶液的吸光度（A0），每个试样作3个平行，取其平均值。数据代入下式计算清除率。

式中：A0为空白对照组的吸光度值；AX为加入样品溶液后的吸光度值；A1样品空白的吸光度值。

1.3.4.3 清除ABTS+·能力的测定[10-12]

将2mL样品溶液加入2mL稀释后的ABTS溶液中，记录7min时反应溶液在734 nm处的A值，记为AX。空白对照组为浸提溶剂与ABTS溶液混合。清除率公式如下：

式中：A0为空白对照液的吸光度值；AX为加入样品溶液后的吸光度值；A1为样品空白的吸光度值。

1.3.4.4 清除DPPH·能力的测定[12-13]

将DPPH以无水乙醇配制成0.2mmol/L的溶液，分别吸取2m L的样品溶液和2m L的DPPH，避光混匀，反应30min于517 nm处测定吸光度值AX。空白对照组为浸提溶剂与DPPH溶液混合。清除率公式如下

式中：A0为空白对照组的吸光度值；AX为加入样品溶液后的吸光度值；A1为样品空白的吸光度值。

2 结果与分析

2.1 乙醇浓度筛选

料液比1∶200，超声浸提15min，乙醇浓度分别为0%、25%、50%、无水乙醇。对超氧自由基和羟自由基清除率见表2。

表2 乙醇浓度的影响Table2 Effectsof SolventConcentration

如表2所示，浸出物对羟基自由基清除率低于超氧阴离子自由基清除率。在乙醇含量0%～25%时浸出液超氧自由基的清除率呈上升趋势，而乙醇含量25%无水乙醇呈下降趋势，因此正交试验选择乙醇浓度20%～50%。

2.2 正交试验

以料液比、超声提取时间、乙醇浓度、提取温度为正交因素，正交试验L9（34）结果见表3。

表3 HO·正交试验结果Table 3 Resultsof HO·O rthogonal Test

续表3 HO·正交试验结果Continue table3 Resultsof HO·Orthogonal Test

由表3，最佳水平分别为：料液比1∶100、浸提时间45min、乙醇浓度50%、浸提温度60℃，最佳组合为A1B3C3D3，清除率为12.78%。各因素影响由大到小为：料液比、浸提时间、浸提温度、乙醇浓度。

表4 O2-·正交试验结果Table 4 Resultsof O2-·OrthogonalTest

由表4，料液比1∶100、浸提时间45min、乙醇浓度35%、浸提温度60℃，超氧自由基的清除效果明显，最佳组合为A1B3C2D3，验证试验结果显示清除率为64.52%。各因素对清除率的影响从大到小依次为：料液比、乙醇浓度、浸提温度、浸提时间。

如表5所示，各组玫瑰花苞提取物均对ABTS＋·有较强的清除作用。各因素的影响从大到小依次为：浸提时间、料液比、浸提温度、乙醇浓度，最佳组合为A2B3C3D1，验证试验结果显示清除率为100%。

由表6，影响浸出物对DPPH·清除率的各因素主次顺序是：料液比、浸提时间、乙醇浓度、浸提温度，最佳组合为A1B2C1D1，验证试验结果显示清除率为93.49%。

表5 ABTS+·正交试验结果Table5 Resultsof ABTS+·Orthogonal Test

表6 DPPH·正交试验结果Table6 Resultsof DPPH·O rthogonal Test

3 结论

玫瑰花苞提取物对HO·、O2-·、DPPH·、ABTS＋4种自由基均有清除作用。其中，对DPPH·、ABTS＋2种自由基的清除能力强，清除率大于90%，对O2-·的清除能力次之，对HO·的清除能力弱。正交试验结果显示，料液比、浸提温度、乙醇浓度、浸提时间4种因素中，料液比和浸提时间对试验影响明显而乙醇浓度、浸提温度影响较小。4种自由基清除率的最佳组合条件不一致。

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Detection of Rosebud Anti-radical Ability

FANChen，XUHui-zhen，LIUGui-qin，ZENGQing-hua，LIYan，SUNXiao-fan
（Agricultural School，LiaoChengUniversity，Liaocheng 252059，Shandong，China）

This paper detects anti-radical ability of Rosebud.Effects of solvent concentration，solid-liquid ratio，extraction time and extraction temperature on extractive scavenging radicals were investigated by orthogonal test.The results showed thateach group of extractive had a scavenging capacity on 1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical（DPPH·），2，2'-Azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate）radical（ABTS+·）up to 90%，while the removalefficiencyof the superoxide anion radical（O2-·）floatswith differentconditions，the hydroxyl radical（·OH）removal rate is less than 10%.Rosebud extractiveshowed scavenging radicalsactivity.

Rosebud；1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH）radical；2，2'-Azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate）（ABTS）radical

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.05.020

2013-11-08

聊城大学博士科研启动基金（31805）

樊琛（1978—），女（汉），副教授，博士，主要从事食品营养与卫生学方向的研究。