鲍曼不动杆菌的耐药情况及碳青霉烯酶基因检测

王晓红， 范学财，2， 张吉生， 王 勇， 郭宇航， 曼 萨， 张晓丽*

(1.佳木斯大学 附属第一医院 检验科，黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯大学 附属第二医院 检验科，黑龙江 佳木斯 154003)



鲍曼不动杆菌的耐药情况及碳青霉烯酶基因检测

王晓红1， 范学财1，2， 张吉生1， 王 勇1， 郭宇航1， 曼 萨1， 张晓丽1*

(1.佳木斯大学 附属第一医院 检验科，黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯大学 附属第二医院 检验科，黑龙江 佳木斯 154003)

了解佳木斯大学附属第一医院鲍曼不动杆菌耐药性及碳青霉烯酶包括苯唑西林酶和金属酶相关耐药基因分布情况，为临床抗菌药物的合理选择提供依据。2013年9月至2014年12月使用VITEK-II全自动微生物鉴定/药敏测试系统筛选出佳木斯大学附属第一医院临床标本鲍曼不动杆菌69株；采用多重PCR方法检测鲍曼不动杆菌携带的碳青霉烯酶相关耐药基因16S rRNA、OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58、IMP、VIM、SIM，并对耐药基因扩增的阳性产物进行DNA 序列分析。69株AB对亚胺培南、美洛培南的耐药率分别为36.2%、37.68%，对其他抗菌药物的耐药率均高于50%。6种耐药基因的检测结果为69株(100%) 携带OXA-51基因，32株(46.4%) 携带OXA-23基因，17株(24.6%) 携带OXA-24基因，5株(7.2%)携带OXA-58基因，1株(1.4%)携带IMP基因。25株碳青霉烯类药物耐药鲍曼不动杆菌中，22株(88%) 携带OXA-23，1株(4%) 携带OXA-58，10株(40%) 携带OXA-24，6株(24%)同时携带OXA-23、OXA-24。 DNA 序列分析结果显示：OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58分别与NCBI 的序列同源性均为99%。产OXA-23 型碳青霉烯酶可能是佳木斯大学附属第一医院鲍曼不动杆菌对碳青霉烯酶类抗菌药物耐药的主要原因，另外佳木斯大学附属第一医院存在OXA-24型耐药基因鲍曼不动杆菌的区域性流行。

鲍曼不动杆菌；碳青霉烯酶；耐药性；耐药基因；苯唑西林酶(OXA)

目前多重耐药和泛耐药的鲍曼不动杆菌检出率逐年升高，其感染率、耐药率及临床致死率也日趋严重，引起广泛关注[1]。碳青霉烯类抗菌药物是迄今抗菌谱最广、抗菌活性最强的一类高效、广谱的β-内酰胺类抗菌药物[2]。伴随碳青霉烯类抗菌药物的临床应用，使耐碳青霉烯类抗生素的鲍曼不动杆菌(Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii, CRAB)不断出现并广泛传播[3-4]。碳青霉烯酶能够水解碳青霉烯类抗菌药物成为碳青霉烯类抗菌药物的主要耐药机制之一[5]。为了解鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶相关耐药基因存在情况，本研究对佳木斯大学附属第一医院2013年至2014年临床分离的69株鲍曼不动杆菌的苯唑西林酶和金属酶基因进行检测并分析。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株来源 佳木斯大学附属第一医院2013年9月至2014年12月临床分离的鲍曼不动杆菌共69株，除去重样本，全部菌株用Vitek II Compact(法国生物梅里埃公司)进行菌种鉴定及体外药物敏感性分析。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 参考文献[6]合成引物，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列及产物长度见表1。

1.2.2 DNA模板制备 用煮沸法制备DNA模板。细菌菌落悬浮于8.5 g/L NaCl中至5个麦氏单位, 13 000 r/min离心2 min，重悬于200 μL的无菌双蒸水， K10CD干式恒温器煮10 min，13 000 r/min离心10 min，上清液DNA保存20 ℃。

1.2.3 PCR扩增及DNA测序 多重PCR检测OXA酶基因(blaOXA-23-like、 blaOXA-24-like、blaOXA-51-like、blaOXA-58-like)反应体系：Platinum Multiplex PCR Master Mix 12.5 μL，Primer(10 μmol/L) 0.2 μL，Template DNA 1 μL，GC Enhancer 2 μL。反应条件: 95 ℃ 2 min；(95 ℃ 30 s，60 ℃ 90 s，72 ℃ 60 s)35个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。16S rRNA、IMP、SIM、VIM反应体系：5×buffer 5 μL, 10 μmol/L dNTP 0.5 μL, 5 U/μLTaq0.2 μL, 10 μmol/L Primer mix 1 μL, 2 ng/μL DNA模板 1 μL。反应条件: 94 ℃，5 min；(94 ℃ 30 s， 58 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s)35个循环； 72 ℃ 10 min，4 ℃保存。5 μL PCR产物2%琼脂糖凝胶进行电泳分析。PCR产物由哈尔滨博仕生物有限公司进行纯化并双向测序，序列与GenBank blast比对进行同源性分析。

表1 扩增各种OXA 及MBL碳青霉烯酶基因的引物序列

2 结果与分析

2.1 标本来源及临床分布

经16S rRNA阳性鉴定,69株均为鲍曼不动杆菌，标本主要来源于痰标本79.7%，其余来自脑脊液、分泌物、血液和伤口脓液分别为10.1%、4.3%、4.3%和1.4%。来源科室ICU 检出率最高，其次为呼吸科和急诊科， 分别为17.4%、14.5%和14.5%。

2.2 鲍曼不动杆菌耐药性

鲍曼不动杆菌的耐药表型结果：69株菌中亚胺培南、美洛培南的耐药株数(耐药率)分别为25株(36.2%)、26株(37.7%)，其余抗生素耐药率均高于50%。

2.3 碳青霉烯酶基因检测结果

69株(100%) 携带OXA-51基因，32株(45.5%) 携带OXA-23基因，17株(24.6%) 携带OXA-24基因，5株(7.2%)携带OXA-58基因，1株(1.4%)携带IMP基因。其中同时含有OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58四种基因的标本2株，OXA-51、OXA-23、OXA-24三种基因阳性标本12株，OXA-51、OXA-58同时阳性样本3株，OXA-51、OXA-24同时阳性样本3株，OXA-51、OXA-23同时阳性样本18株(图1)。含有DNA 序列分析结果显示:OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58分别与NCBI 的序列同源性均为99%。经测序与GenBank公布的核酸序列99%同源。

图1 多重PCR检测OXA基因电泳图Fig.1 Electrophoretogram of OXA gene DNA by Multiplex PCR method

12～44：样本序号；39：阴性对照；M：DNA marker

12～44：indicate samples number; 39：indicates negative control; M：indicates DNA marker

25株碳青霉烯类药物耐药鲍曼不动杆菌中，22株(88%) 携带OXA-23，1株(4%) 携带OXA-58，10株(40%) 携带OXA-24，6株(24%)同时携带OXA-23、OXA-24。另外将OXA-24基因与NCBI Blast 比对后发现为OXA-72亚基因型(图2)。

图2 OXA-24序列 NCBI Blast 比对结果Fig.2 Sequence alignment of OXA-24 by NCBI Blast

3 讨 论

1991年，美国报道了首例对碳青霉烯类抗生素耐药的鲍曼不动杆菌，随之世界各地相继出现鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药且逐年增高， 研究发现鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性与产碳青霉烯酶关系密切。碳青霉烯酶主要是Ambler 分子结构分类法中的B类和D类β-内酰胺酶， B类酶就是金属酶(metallo-beta-lactamases，MBLs) ，能高效水解β-内酰胺类药物，发挥活性需要金属离子Zn2+，获得性金属酶可分为5型IMP、VIM、SIM、SPM和GIM[7-8]， 国内金属酶分离率远远低于blaOXA基因的分离率，本研究对前三型进行检测，检测出1株IMP基因阳性株，IMP阳性株对亚胺培南体外敏感，说明其介导耐药可能与I类整合子相关。

D类酶又称苯唑西林酶(Oxacillin-hydrolyzing, OXA)，因其可水解苯唑西林而命名，其催化机制是在丝氨酸催化底物和酶形成一个共价酰基中间产物，并随后脱酰化使β-内酰胺环上C-N连接水解，导致药物失活[9]，发现主要包括6个亚组，分别为OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58、OXA-143和最近发现的OXA-235[10]。本研究中发现同时携带OXA-51和OXA-23基因的菌株对碳青霉烯类抗生素抗菌药物的耐药率达到87.5%，呈现多重耐药和广泛耐药，提示携带OXA-23基因可能是导致鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要机制之一，这与其他国内外报道一致[11]。另外本研究中发现14株鲍曼不动杆菌含有OXA-24基因，我国大部分地区以OXA-51、OXA-23为组，OXA-24检出极少[12]，OXA-24曾在欧洲包括美国、西班牙、德国、韩国、克罗地亚等地暴发[13-15]，2004年我国台湾首次报道OXA-24产酶株之后，我国大陆地区2006年也发现同亚型株[11]。OXA-24亚组包括OXA-40(与OXA-24相似)、OXA-25、OXA-26和OXA-72，本研究检测出的OXA-24基因测序后Blast比对与OXA-72 同源性为99%，是否说明我国黑龙江东部地区有局部范围OXA-72鲍曼不动杆菌流行有待进一步研究，其样本来源包括ICU、急诊、神经外科、神经内科、呼吸科、血液科、放化疗等科室，科室分散，但CRAB中携带OXA-24的菌株中有40%，其与碳青霉烯酶等抗生素多重耐药可能相关。OXA-58组主要是OXA-58和OXA-97，是一种新的质粒介导的D类酶，与OXA-51的同源性约59%，能水解青霉素、苯唑西林和亚胺培南，但不能水解头孢菌素类[16]。本研究结果中OXA-58基因检出率较低，且仅有1株携带OXA-58基因为亚胺培南耐药。

本研究中鲍曼不动杆菌检测结果以携带OXA-23基因为主且耐药性较强，另外发现有部分菌株携带OXA-24基因，为本地区鲍曼不动杆菌的流行病学研究提供科学依据。当鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药时，临床医师可选择药物会更少。因此，在临床上应重视预防对碳青霉烯类抗生素耐药鲍曼不动杆菌的传播且合理选用抗菌药物治疗。

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Carbapenemase Gene Detection of Acinetobacter baumannii in the Hospital

WANG Xiao-hong1, FAN Xue-cai1，2, ZHANG Ji-sheng1,WANG Yong1, GUO Yu-hang1, SEDZRO Divine Mensal1, ZHANG Xiao-li1

(1.Dept.ofLab, 1st.Affil.Hosp.,JiamusiUni,Jiamusi154007; 2.Dept.ofLab, 2ndAffil.Hosp.,JiamusiUni.,Jiamusi154003)

In order to understand the distribution ofAcinetobacterbaumanniidrug-resistance and carbapenemase including oxacillinase (OXA) and metalloenzyme (MLE) related resistance genes in the affiliated hospitals of Jiamusi University to provide a foundation for reasonable choice of clinical antibiotic medicine. 69A.baumanniistrains were collected and screened in the hospital clinical samples identified by VITEK-II full-automatic microbial identification/susceptibility testing machine from September 2013 to December 2014. Multiplex PCR detection method was used to detect carbapenemase related resistant genes 16S rRNA, OXA-23, OXA-24, OXA-51, OXA-58, IMP, VIM and SIM. The positive amplified products were subjected to DNA sequence analysis. The results showed that the resistant rate of 69 strains to IMP and MEM were 36.2% and 37.68%. The resistant gene was obtained as follows: 69 (100%) carrying OXA-51 gene, 32 (46.4%) carrying OXA-23 gene, 17 (24.6%) carrying OXA-24 gene, 5 (6.8%) carrying OXA-58 genes. Out of 25 carbapenem resistant strains ofA.baumanniiidentified, 22 (88%) carried OXA-23, 1 (4%) carried OXA-58, 10 (40%) carried OXA-24, and 6 (24%) carried both OXA-23 and OXA-24. DNA sequence analysis of OXA-23, OXA-24, OXA-51 and OXA-58 with the NCBI sequence showed 99% homology. Therefore, the OXA-23 gene producer may be responsible for the main reason ofA.baumanniicarbapenemase antibiotic resistance. Moreover, there exists regional epidemic of OXA-24 drug resistant geneA.baumanniiin the hospital.

Acinetobacterbaumannii; carbapenemase; drug resistance; resistant gene；oxacillinase

黑龙江省自然科学基金项目(D201224)；黑龙江省卫生厅科研项目(2013-226)；佳木斯大学研究生科技创新项目(LZZ2014_022)

王晓红 女，副主任技师。研究方向为临床微生物耐药机制的研究。Tel:0454-8606771，E-mail:xiaolizhangcmu@yeh.net

* 通讯作者。女，副教授，博士，硕士研究生导师。研究方向为临床微生物耐药机制的研究。Tel:0454-8801816，E-mail: jmszxl@163.com

2015-03-12；

2015-04-14

Q939.93; R378.991

A

1005-7021(2015)04-0059-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.04.011