人线粒体DNA缺失宫颈癌细胞及其转线粒体细胞的建立与初步分析

温超玮，叶薇，周怀彬，吕建新，李伟

（温州医科大学 检验医学院 生命科学学院 浙江省医学遗传学重点实验室，浙江 温州 325035）

·论 著·

人线粒体DNA缺失宫颈癌细胞及其转线粒体细胞的建立与初步分析

温超玮，叶薇，周怀彬，吕建新，李伟

（温州医科大学 检验医学院 生命科学学院 浙江省医学遗传学重点实验室，浙江 温州 325035）

目的：探讨溴化乙锭（EB）诱导法建立人线粒体DNA（mtDNA）缺失宫颈癌Hela S3细胞，以及再转入线粒体构建融合细胞的可行性，并对转线粒体细胞进行初步分析。方法：采用低剂量（100 ng/mL）EB诱导法建立mtDNA缺失的ρ0Hela S3细胞，通过普通PCR、荧光定量PCR（qPCR）进行mtDNA缺失鉴定。采用聚乙二醇（PEG）介导细胞融合法，以正常人血小板为mtDNA供体转入ρ0Hela S3细胞，构建转线粒体细胞（transmitochondrial cybrids），并通过PCR、qPCR和透射电镜观察进行初步分析和鉴定。结果：普通PCR和qPCR结果证实EB诱导法能够成功建立ρ0Hela S3细胞，同时结合透射电镜证明转线粒体细胞能够恢复线粒体正常结构。结论：采用EB诱导法可成功建立ρ0Hela S3细胞，且通过细胞融合构建的转线粒体细胞能够恢复mtDNA复制和正常线粒体结构，为研究mtDNA突变与线粒体功能异常相关疾病的关系提供可靠的实验基础。

线粒体DNA缺失细胞；转线粒体细胞；线粒体DNA拷贝数；线粒体嵴

近数十年来，影响全球人类健康的许多疾病被证实与线粒体功能紊乱相关。研究发现，线粒体功能异常能够累及机体的神经传递、能量代谢、内环境平衡等，进而促进如阿尔茨海默病、帕金森氏症、Leber’s遗传性视神经病变、糖尿病、耳聋、冠心病、原发性高血压等疾病的发生[1-4]。自King等[5]利用溴化乙锭（ethidium bromide，EB）诱导构建线粒体DNA（mtDNA）缺失细胞（ρ0cell）后又成功以血小板为外源mtDNA供体与细胞进行融合，ρ0细胞和转线粒体细胞（transmitochondrial cybrids）已成为目前线粒体相关疾病的细胞生物学研究的主要方法之一。许多研究证实，将线粒体功能异常相关疾病患者的血小板与不同来源的ρ0细胞融合构建的转线粒体细胞能表现出一定程度的线粒体功能障碍[6-9]。本实验采用传统EB诱导法构建ρ0Hela S3细胞，并通过再转入正常外源线粒体，初步探讨转线粒体细胞的线粒体功能是否能够恢复，为后续研究mtDNA突变与线粒体疾病发生发展的关系提供可行的技术平台。

1 材料和方法

1.1 材料 主要材料：人宫颈癌Hela S3细胞株（由Carolyn Suzuki Laboratory惠赠），透析/普通胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）购于Biochrom公司，丙酮酸钠（pyruvate）、高糖DMEM培养液（pyruvate free）购于Gibco BRL公司，EB、尿嘧啶核苷（uridine）购于Sigma公司，聚乙二醇（PEG-1500）购于Fluka试剂公司，DMSO、胰酶细胞消化液购于碧云天生物技术研究所，Universal Genomic DNA Extraction Kit、Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）购于Takara宝生物（大连）有限公司。

1.2 ρ0Hela S3细胞的构建 参照文献[5]报道，将Hela S3细胞在含100 ng/mL EB的DMEM培养液（含10% FBS、50 μ g/mL尿嘧啶核苷和100 μ g/mL丙酮酸钠）中培养。3～5 d传代一次，诱导培养至2个月后挑取单克隆ρ0Hela S3细胞接种至24孔板，换用不含EB的DMEM培养液（含10% FBS、50 μ g/mL尿嘧啶核苷和100 μ g/mL丙酮酸钠）进行扩大培养。

1.3 ρ0Hela S3细胞的鉴定 收集处于对数生长期的ρ0Hela S3细胞，用DNA提取试剂盒提取细胞总DNA，根据文献[10]报道分别扩增线粒体基因片段和核基因片段，并通过1.5%琼脂糖凝胶电泳进行结果分析。采用TaqMan相对荧光定量PCR（qPCR）的方法，以APP基因为内参基因，扩增mtDNA D-loop基因来检测细胞mtDNA拷贝数的变化，相关引物和探针序列见表1-2。

表1 普通PCR引物序列

表2 荧光定量PCR引物和探针序列

1.4 转线粒体细胞的构建 参照文献[11]，将分离得到的健康正常人血小板，与ρ0Hela S3细胞在37 ℃、新鲜配制的42% PEG溶液中迅速、充分混匀后加入DMEM培养液（含10% FBS、50 μ g/mL尿嘧啶核苷、100 μ g/mL丙酮酸钠）培养。3 d后换用DMEM选择培养液（含10%透析FBS，不含尿嘧啶核苷和丙酮酸钠）继续培养。30 d后挑取单克隆细胞进行扩大培养。

1.5 转线粒体细胞的鉴定 分别收集处于对数生长期的ρ0Hela S3细胞、转线粒体细胞和Hela S3细胞，采用试剂盒法分别提取3组细胞基因组DNA，通过普通PCR、qPCR检测细胞mtDNA扩增情况和mtDNA拷贝数的变化，相关引物和探针序列见表1-2。用常规方法[12-13]制备超薄切片，透射电镜观察细胞内线粒体形态。

1.6 统计学处理方法 采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。计量资料采用独立样本t检验，实验数据以±s表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 mtDNA基因电泳分析 1.5%琼脂糖凝胶电泳结果显示，ρ0Hela S3细胞、转线粒体细胞和Hela S3细胞均能在218 bp处出现相应核基因片段条带（见图1a），ρ0Hela S3细胞（见图1b，泳道HS-）在940 bp处没有相应条带，而转线粒体细胞和Hela S3细胞（见图1b，泳道HS-T和HS）则可扩增出相应条带。

2.2 mtDNA拷贝数测定 qPCR结果显示，EB诱导Hela S3细胞发生mtDNA拷贝数进行性下降，若诱导6 d后撤除EB，mtDNA拷贝数发生逐渐恢复现象（见图2a）。而EB诱导培养2个月后挑取单克隆扩大培养的ρ0Hela S3细胞则保持较低水平的mtDNA拷贝数（见图2b）。

图1 PCR产物电泳图

2.3 转线粒体细胞形态学观察 挑取单克隆转线粒体细胞进行筛选实验，第5天可在显微镜下观察到未融合细胞逐渐死亡（见图3a），第10天融合成功的细胞小克隆群开始形成（见图3b），第20天左右出现较大的融合细胞克隆群（见图3c）。

2.4 线粒体结构的观察 透射电镜结果显示，ρ0Hela S3细胞内线粒体嵴结构被破坏，内部呈现同心圆结构（见图4a，箭头所指部位）。而转线粒体细胞中线粒体嵴结构完整，内部排列较整齐（见图4b），与Hela S3细胞线粒体结构类似（见图4c）。说明外源线粒体已成功转入ρ0Hela S3细胞。

图2 mtDNA拷贝数qPCR分析结果图

图3 转线粒体细胞筛选实验结果图（×200）

图4 细胞透射电镜结果图

3 讨论

氧化磷酸化是机体内由核DNA和mtDNA共同参与编码调控的生化途径，核DNA和mtDNA突变的积累都可能影响线粒体呼吸链复合体的功能。运用细胞融合技术将外源mtDNA导入ρ0细胞构建的转线粒体细胞能够有效排除核基因的干扰[14-16]，在统一核背景下研究mtDNA突变对线粒体呼吸链的影响。研究[17-20]发现，通过这种方法可以更好地关注mtDNA突变在氧化磷酸化过程中对线粒体呼吸链复合体的表达以及活性的发挥有何影响，从而探讨其与线粒体疾病发生发展的关系。

构建转线粒体细胞的必需要素之一是ρ0细胞的制备，EB诱导是其中最经典的方法。研究[13]表明，EB诱导细胞mtDNA缺失依赖于mtDNA复制持续性抑制的过程。在实验中，我们发现以低剂量（100 ng/ mL）EB诱导培养Hela S3细胞能够进行性降低细胞mtDNA拷贝数，且诱导6 d后撤除EB，mtDNA拷贝数会发生逐渐恢复的现象。而EB诱导培养2个月后挑取单克隆扩大培养的ρ0Hela S3细胞则能保持较低水平的mtDNA拷贝数。这证实了EB诱导细胞mtDNA缺失是一个长期积累的过程。PCR是鉴定mtDNA缺失的常规方法之一，本实验通过普通PCR和qPCR检测mtDNA扩增情况和mtDNA拷贝数，证实ρ0Hela S3细胞mtDNA的缺失。同时透射电镜结果也表明，ρ0Hela S3细胞的线粒体表现为嵴结构被破坏和典型的同心圆结构。

细胞融合技术是转线粒体细胞制备的常用方法，PEG介导血小板导入ρ0细胞是最简单易行的。在实验中，我们通过选择培养筛选融合成功的转线粒体细胞，采用普通PCR、qPCR和透射电镜证实了转线粒体细胞mtDNA拷贝数恢复，线粒体嵴结构完整，内部排列较整齐。以上结果都说明转入正常线粒体后，转线粒体细胞能够恢复mtDNA的正常复制以及完整线粒体结构。

本实验证实，采用EB诱导法可成功构建具有低mtDNA拷贝数和异常线粒体结构的ρ0Hela S3细胞，而通过细胞融合转入正常外源线粒体的转线粒体细胞能够恢复mtDNA复制和正常线粒体结构，为后期研究mtDNA突变对线粒体功能以及相关疾病的影响奠定了坚实可靠的基础。

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（本文编辑：吴健敏）

Establishment and preliminary analysis on mtDNA-depleted cells and transmitochondrial cybrids

WEN Chaowei, YE Wei, ZHOU Huaibin, LV Jianxin, LI Wei. Zhejiang Provincial Key Laboratory of Medical Genetics, School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective: To generate mtDNA-depleted Hela S3 cells and the transmitochondrial cybrids and investigate mtDNA replication and mitochondrial structure. Methods: Hela S3 cells were incubated with 100 ng/ mL ethidium bromide (EtBr). Polymerase chain reaction (PCR) and quantitative real-time PCR (qPCR) were performed in ρ0Hela S3 cells. Platelet-mediated transmitochondrial cybrids were established on the basis of ρ0Hela S3 cells and identified by PCR, qPCR and transmission electron microscopy (TEM). Results: ρ0Hela S3 cells had a low level of mtDNA replication and distorted cristae of mitochondria, whereas transmotichondrial cybrids had a normal mtDNA replication and regular arranged cristae of mitochondria. Conlusion: The generation of transmitochondrial cybrids provides a viable method for the further research of the effect of mtDNA mutations on mitochondrial respiratory function associated with diseases.

mtDNA-depleted cells; transmitochondrial cybrids; mtDNA copy numbers; cristae of mitochondria

Q2-33

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.06.003

2015-03-07

国家自然科学基金资助项目（81271918）。

温超玮（1987-），女，浙江苍南人，实验员。

李伟，副教授，Email：liweiwzmc@163.com。