银耳污染菌的分离鉴定及其抑菌活性物筛选*

陈 宏，贾 纬，聂毅磊，罗立津

（福建省微生物研究所福建省新药（微生物）筛选重点实验室，福建 福州 350007）

银耳污染菌的分离鉴定及其抑菌活性物筛选*

陈 宏，贾 纬，聂毅磊，罗立津

（福建省微生物研究所福建省新药（微生物）筛选重点实验室，福建 福州 350007）

为控制银耳（Tremella fuciformis）污染菌杨梅霜菌的危害，提供高效防治活性物质。用平板分离纯化获得了杨梅霜菌菌株YC，鉴定其为链霉菌属（Streptomyces sp.）的种类。采用培养皿圆滤纸片法，测定12种活性物对菌株YC及银耳伴生菌香灰菌（Hypoxylon sp.）生长的抑制作用，在12种活性物中，链霉菌发酵产物SM（福建省微生物研究所提供）对菌株YC的抑制作用较强，且对银耳伴生菌香灰菌的生长基本无抑制作用，有望成为扩大试验的供试物。

银耳；链霉菌属；活性物质；筛选；抑制效果

在银耳栽培过程中，常会遭遇到环境中致病微生物的污染，导致其减产，杨梅霜菌是引起银耳栽培中一种常见病害的病原菌。肉眼观察，杨梅霜菌呈白色小颗粒状，很像杨梅干、柿丸干上霜后的形态。因该病害的症状与杨梅霜相似，所以取名为“杨梅霜菌”[1]。据报道，杨梅霜菌是放线菌类，主要为链霉菌属、游动放线菌属和诺卡氏菌属的种类[2]；也有研究认为它是一种半知菌[3]。通常杨梅霜菌在银耳母种和原种前、中期是很难发现的，往往只有严重感染后才能被发现。目前还没有特别有效、针对性强的防治方法，主要还是通过在生产中改善培养环境条件来进行预防性控制。为此，我们从四州简阳被污染的银耳瓶中分离得到杨梅霜菌，对其进行了菌种鉴定。为控制其危害，提供高效防治药剂，筛选12种活性物质，通过测定对该病菌的抑菌圈大小，确认供试物质的抑菌能力，并依据其对银耳伴生菌是否有抑制性，筛选出可供进一步实际应用的有效活性物质。现将结果报道如下。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1培养基

PDA培养基：去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL。

银耳固体培养基：木屑70%、麦麸28%、石膏粉2%，均匀拌料，按1∶1.25加水混合。

1.1.2样品

污染了杨梅霜菌的银耳栽培种瓶，由四川简阳某食用菌基地提供。

1.1.3菌株

香灰菌株（Hypoxylon sp.），由四川简阳某食用菌基地提供。

1.1.4供试活性物质及提供商

四霉素，辽宁微科生物工程有限公司；武夷霉素，福建省微生物研究所；宁南霉素，德强生物股份有限公司；CL、SM、ZS三者均为链霉菌发酵代谢产物，由福建省微生物研究所提供；井冈霉素，武汉科诺生物科技股份有限公司；百菌清，江苏利民化工股份有限公司；甲基托布津，江功龙灯化学有限公司；多菌灵，四川国光农化股份有限公司；氟吗霜，旭日化工（山东）有限公司；恶霉灵，四川国光农化股份有限公司。

1.2试验方法

1.2.1杨梅霜菌的分离纯化

从银耳染菌瓶中取少量基质，置于无菌水中，用玻璃珠打散，吸原液及稀释液0.1 mL在PDA平板上涂布，平板28℃培养1周。观察菌落形态和显微形态，将单菌落挑至PDA斜面培养。

1.2.2菌种鉴别

（1）形态培养特征

单分离菌株的斜面培养物划线于PDA平板，斜插盖玻片，28℃培养4 d～6 d，观察气生菌丝、基内菌丝及色素变化情况。培养特征和生理生化特性试验采用《链霉菌鉴定手册》[4]中推荐的培养基进行培养、观察和描述。

（2） 16S rRNA基因的PCR扩增及基于16S rRNA基因序列的系统发育分析

菌株基因组DNA采用酶解法提取，得到的DNA样品-20℃贮存。其可作为DNA模板进行16S rRNA基因PCR扩增，PCR产物送铂尚生物技术（上海）有限公司测序。将所测菌株的16S rRNA序列与GenBank数据库中已有序列比对，进行同源性分析鉴定。

1.2.3抑菌活性物质筛选

用培养皿圆滤纸片法对供试的12种活性物质进行抑菌圈测定。将PDA培养基倒入培养皿中，制成厚5 mm的平板培养基，凝固后，将培养24 h的杨梅霜菌，用无菌水制备菌悬液，涂布到平板表面；待菌液干后，将药敏纸片（直径为5 mm，厚约1 mm）置入培养皿，每皿4片，28℃培养48 h，测定抑菌圈直径。

香灰菌（Hypoxylon sp.）是一种半知菌，对银耳的栽培出耳至关重要，被称为银耳的“伴生菌”[5-6]。杨梅霜菌最喜寄生于香灰菌菌丝体中[7]。银耳在PDA平板培养基上生长十分缓慢，故选用银耳的伴生菌香灰菌，来考察所选活性物质对其是否有抑制作用。上述实验中抑菌圈较大的活性物质，再进行银耳的伴生菌香灰菌的抑菌试验。最终选取既能抑制杨梅霜菌生长，又较少抑制香灰菌生长的活性物质。

1.2.4活性物SM、ZS、CL在高温灭菌后对杨梅霜菌菌株YC的抑制能力

由于银耳培养时培养基需要高温灭菌，如果所筛选的药物能和培养基一起灭菌又不失活性，则有利于将来的扩大应用。将所筛选的药物加入到PDA培养基中，与培养基一起灭菌后接入杨梅霜菌菌株YC，培养7 d，观察药物对该菌的抑制作用。

2　结果与分析

2.1菌种分离和鉴别

在PDA平板上分离纯化后得到菌落形态一致的杨梅霜菌株，在PDA培养基上菌落呈白色，圆形微凸状，质地较致密坚硬，具有放线菌菌落的特征，菌落背面产生橙红色色素，见图1。

选取其中1株编号为YC的菌株，回接到已接入银耳菌株的银耳固体培养基中，在25℃下培养，约1周内出现与四川简阳某食用菌基地提供的污染了杨梅霜菌的银耳栽培种瓶相同的染病症状，说明菌株YC是污染菌。

将菌株YC进行菌种鉴定，提取菌株总DNA，进行16S rRNA序列扩增，并进行序列测定，用BLAST软件与NCBI的GenBank数据库的16S rRNA进行比对，结果表明，其大小为1 386 bp，与Streptomyces sp.Js-1（2011） 的同源性最高，相似性达99%（图2）。说明该菌株YC属于链霉菌属。

图1　疑似杨梅霜菌菌株YC的菌落形态Fig.1　Colonial morphology of strain YC

图2　菌株YC和相关序列菌株构建系统发育树Fig.2　The phylogenetic tree formed by strain YC and 3 strains of Streptomyces sp.

该菌株能利用葡萄糖、果糖、乳糖、鼠李糖、甘油、酒石酸甲钠、柠檬酸钠、乙酸钠、阿拉伯糖，不能利用蔗糖、麦芽糖、甘露醇、半乳糖、棉籽糖、木糖、琥珀酸钠、草酸钠、肌醇，不能水解纤维素。能液化明胶，胨化牛奶，并使石蕊牛奶还原褪色，不产生硫化氢。

2.2供试活性物质对杨梅霜菌菌株YC的抑菌效果

应用培养皿圆滤纸片法测定12种供试活性物质对菌株YC的抑菌能力，结果如表l所示。

从表1可以看出，四霉素、百菌清、氟吗霜、链霉菌发酵代谢产物（CL、SM、ZS）中共6种能形成抑菌圈，抑菌圈的直径大小依次为四霉素＞SM＞氟吗霜/ZS＞百菌清＞CL。

2.3供试活性物质对银耳伴生菌香灰菌的抑制作用

银耳在PDA平板培养基上生长十分缓慢，故选用银耳的伴生菌香灰菌，来考察所选活性物质对其是否有抑制作用。由于百菌清的抑菌圈不透明，故弃去不选。选取四霉素、SM、氟吗霜、ZS、CL进行香灰菌生长抑制试验，其结果见表2。

表1　供试活性物质对菌株YC抑菌圈直径的影响Tab.1　Effect of active material on diameter of suppressed germ circle of the strain YC

表2　供试活性物对银耳伴生菌香灰菌的抑制作用Tab.2　Inhibitory effects of the active materials on Hypoxylon sp.

表2的结果表明，链霉菌发酵代谢产物SM、ZS、CL，有望成为扩大试验的供试药物。

2.4活性物质SM、ZS、CL在高温灭菌后对杨梅霜菌菌株YC的抑制能力

将所筛选的活性物质加入到PDA培养基中，与培养基一起灭菌后接入杨梅霜菌菌株YC，结果见表3。

经培养、观察后发现，SM在浓度25 μg·L-1以上时仍有抑菌能力，但CL、ZS在浓度50 μg·L-1时仍无法抑制菌株YC的生长，说明可能高温灭菌破坏了其杀菌能力。

3　结论

食用菌生长过程被认为是食用菌同杂菌作斗争的过程，所以食用菌栽培成败的关键取决于抗杂菌水平的高低。目前，生产上仍采用药物防治来抑制杂菌生长，因此，筛选能有效抑制杂菌繁殖，又不影响食用菌生长的药物具有重要意义。链霉菌发酵代谢活性物质SM，既能抑制杨梅霜菌生长，又基本不抑制银耳伴生菌的生长，且耐高温灭菌，有望成为扩大试验的供试药物。

表3　SM、ZS、CL高温灭菌后对杨梅霜菌YC的抑制能力Tab.3　Inhibitory effects of SM,ZS and CL on the strain YC after high temperature setrilization

[1]陈初旭.袋栽银耳两大病害发生原因初探[J].中国食用菌，1996，15（6）：37-38.

[2]张海风.银耳菌袋中主要污染菌的分离鉴定及微生物的TRFLP分析[D].福州：福建农林大学，2011.

[3]黄年来.中国银耳生产[M].北京：中国农业出版社，2000.

[4]中国科学院微生物研究所放线菌分类组.链霉菌鉴定手册[M].北京：科学出版社，1975.

[5]梁勤.我国银耳种质资源遗传多样性分析及木质素、纤维素酶活测定[D].雅安：四川农业大学，2010.

[6]汪国莲，陈立国，陈明.银耳菌丝生长营养条件的初步研究[J].中国食用菌，2001，20（4）：12-14.

[7]戴维浩，戴伟鸿.银耳杨梅霜菌的污染现象和防治方法[J].浙江食用菌，2010，18（2）：48.

Isolation and Identification of the Contaminative Microorganism from Tremella fuciformis Fungus and Inhibitory Effects of Active Materials on Streptomyces sp.

CHEN Hong,JIA Wei,NIE Yi-lei,LUO Li-jin
(Fujian Institute of Microbiology,Fujian Provincial Key Laboratory of Screening for Novel Microbial Products,Fuzhou 350007, China)

In order to screening the effective materials to inhibit the contaminative microorganism from Tremella fuciformis fungus,the contaminative microorganism named Yangmeishuang,was isolated by plate isolation method.The strain was named YC, which belonged to the genus Streptomyces.The inhibitory effects of 12 active materials on the strain YC were determined by using filter paper method,and the inhibitory effects of the selected effective materials on Hypoxylon sp.which is the cohabitant fungus of T.fuciformis were examined.The effective material SM produced by Streptomyces(provided by Fujian Institute of Microbiology)had more powerful inhibitory effect on strain YC and little inhibitory effect on Hypoxylon sp..It meaned that the effective material SM could be used to control the contaminative microorganism from T.fuciformis fungus.

Tremella fuciformis;Streptomyces;active material;screening;inhibitory effect

S646.9A1003-8310（2015）05-0060-04

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.05.015

福州市科技计划项目（2013-G-97）。

陈宏（1966-），女，硕士，高级工程师，主要从事环境微生物领域的研究。E-mail:peaceful88@163.com

2015-07-04