蝙蝠TRAIL基因的克隆·表达及生物学功能分析

蝙蝠TRAIL基因的克隆·表达及生物学功能分析

裴丽丽1，2，侯欢欢1，卢 佳1，闫伟莉1，任文华1*

(1.南京师范大学生命科学学院，江苏南京 210046；2.南京医科大学康达学院，江苏连云港 222000)

摘要[目的]克隆蝙蝠TRAIL基因，构建蝙蝠可溶性TRAIL原核表达栽体，研究其对肿瘤细胞凋亡的影响。[方法]通过RT-PCR技术克隆蝙蝠TRAIL的全长cDNA序列，实时荧光定量PCR鉴定其组织分布，将其可溶性片段与表达载体pET43.1a连接，并在大肠杆菌BL21中高效表达和纯化，通过western blotting证实。体外，通过MTT、TrypanBlue和流式细胞术检测纯化的可溶性TRAIL蛋白能否诱导肿瘤细胞的凋亡。[结果]成功克隆蝙蝠TRAIL基因，构建了重组表达载体，获得可溶性TRAIL蛋白。体外试验证明，可溶性蝙蝠TRAIL蛋白能够诱导Jurkat细胞和HeLa细胞的凋亡。 [结论]可溶性蝙蝠TRAIL蛋白可诱导肿瘤细胞凋亡，该研究为蝙蝠免疫系统的研究奠定了基础。

关键词TRAIL；蝙蝠；荧光实时定量PCR；细胞凋亡

中图分类号S188

基金项目国家自然科学

作者简介裴丽丽(1987- )，女，山东临沂人，助教，硕士，从事生物大分子活性物质研究。*

收稿日期2015-06-09

The Cloning, Expression and Biological Function of the Bat TRAIL Gene

PEI Li-li1,2, HOU Huan-huan1, LU Jia1, REN Wen-hua1*et al(1. College of Life Sciences, Nanjing Normal University, Nanjing, Jiangsu 210046; 2. Kangda College of Nanjing Medical University, Lianyungang, Jiangsu 222000)

Abstract[Objective] To clone gene of the bat TRAIL and construct its soluble prokaryotie expression vector, and investigate its effect on tumor cell apoptosis. [Method] The full-length cDNA of TRAIL from the bat was cloned using RT-PCR techniques. Using real-time PCR to identify its tissue distribution, and its soluble TRAIL gene was linked with pET43.1a, efficiently expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) and confirmed by Western blot analysis. In vitro, the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrasodium bromide (MTT) assay, TrypanBlue and Flow Cytometry analysis the purified soluble TRAIL could induce the apoptosis of tumor cells or not. [Result] The bTRAIL was successfully constructed and obtained a soluble bTRAIL protein. In vitro, the soluble bTRAIL could induce the apoptosis of Jurkat and HeLa cells. [Conclusion] The purified soluble bTRAIL protein can induce the apoptosis of the tumor cells. These results about bTRAIL gene would provide a basis for understanding the characteristics of the immune system of the bat.

Key wordsTRAIL;Pipistrellusjavanicus; Real-time PCR; Apoptosis

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)是肿瘤坏死因子TNF超家族成员之一，通过2个不同的受体(TRAIL-R1，TRAIL-R2)，启动不同的细胞效应，包括细胞的存活、活化、增殖、分化和细胞死亡[1-2]。它还可以在感染部位和有害的全身效应部位导致局部组织损伤[3]。在哺乳动物中，肿瘤坏死因子超家族成员主要包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、Fas配体(CD95配体)和肿瘤坏死因子(TNF)相关的凋亡诱导配体(Apo2L/TRAIL)[4-6]。TRIAL广泛表达于许多组织中，包括外周血淋巴细胞、脾、前列腺、卵巢、小肠、大肠、胎盘、肺、肝和肾等，但在正常人脑组织、肝细胞和睾丸组织中未见表达。TRAIL能够诱导肿瘤细胞、转化细胞和病毒感染细胞等凋亡，而对正常组织无影响。表明TRAIL具有潜在的癌症治疗作用[7-8]。

关于蝙蝠和病毒的大多数知识都是由狂犬病病毒的研究获得的[9]。然而，近年来，在医学上，人类和兽类的许多新病毒已被发现寄生在蝙蝠中。目前，已经有超过100个病毒被检测到寄生于蝙蝠。这些病毒在人类和其他物种均能引起疾病，但在自然或试验感染蝙蝠后不会引起蝙蝠产生疾病[10-12]。说明蝙蝠可能具有自己独特的免疫机制。目前，关于蝙蝠的研究主要集中在生态和生理方面，而关于蝙蝠免疫系统的研究很少[13-14]。笔者克隆的蝙蝠TRAIL基因是第一个被克隆的翼手目哺乳动物TRAIL基因，TRAIL基因的克隆、表达及功能研究有助于探索翼手目哺乳动物的免疫机制，为阐明蝙蝠免疫系统的特点提供依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物、细胞和宿主菌。蝙蝠是从南京师范大学生命科学学院动物所杨光教授实验室获得。大肠杆菌E.coli、Top10、BL21和pET43.1a由南京师范大学分子生物学实验室保存；pMD19-T载体购于TaKaRa公司。

1.1.2试剂。动物组织RNA提取试剂盒(RNeasy Mini Kit，Qiagen)；PrimeScriptTM1st Strand cDNA合成试剂盒、pMD19-T载体试剂盒、TaqDNA聚合酶、感受态细胞制备试剂盒、蛋白Marker、荧光定量PCR试剂盒、rTaq酶、限制性内切酶等均购自TaKaRa公司；鼠His6一抗，辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG购自TIANGEN公司；FITC标记的羊抗鼠IgG抗体(R&D Systems Inc.，USA)；所有引物合成及测序由上海英俊公司完成。

1.2方法

1.2.1蝙蝠脾脏总RNA的提取。利用动物组织RNA提取试剂盒，按照说明书操作，提取蝙蝠脾脏细胞的总RNA。

1.2.2蝙蝠TRAIL(bTRAIL)基因的克隆。通过序列比对分析已知的人、狗、马和鼠TRAIL cDNA序列，设计简并引物：正义引物bTRAIL F1：5′-ATAATGGCCCCAGAGAAGTCCAG-3′；反义引物bTRAIL F2：5′-CTAGCCAATTAAAAAGGCCCCAA-3′。 用上述引物进行RT-PCR。扩增参数：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃延伸30 s，72 ℃退火1 min，35个循环；72 ℃延伸7 min。进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果。按Axygene公司的DNA胶回收试剂盒操作进行割胶回收约843 bp的DNA片段。用clastalW软件对蝙蝠TRAIL序列和其他已知物种TRAIL序列进行序列比对。

1.2.3Real-time qPCR检测TRAIL的组织分布。解剖蝙蝠，提取蝙蝠脾、心、肝、肾、肺、肠等组织的总RNA，用Primer 3 Input 软件设计蝙蝠TRAIL和内参GAPDH引物如下：bTRAIL引物：btTRAILF1：5′- CCCTGCTGGCAAGTAAAGTG-3′；btTRAILF2：5′- CATGCCCTGAGTTTTCCCTG-3′。GAPDH引物：btGAPDH1：5′- GAGCTGAATGGGAAGCTCAC-3′；btGAPDH2：5′- GGAGGAGTGGGTGTCACTGT-3′。Real-time PCR反应程序：94 ℃ 5 min；40个循环(94 ℃ 15 s；62 ℃ 20 s；72 ℃ 15 s)。分别取3 μl PCR扩增产物，以2﹪的琼脂糖凝胶检测PCR产物是否为单一特异性条带。

1.2.4融合表达载体pET43.1a-bsTRAIL的构建。据bTRAIL的胞外可溶片段设计一对含有pET43.1a酶切位点的基因特异性引物，扩增可溶性蝙蝠TRAIL片段(命名为bsTRAIL)，引物如下：bsTRAILF1：CCGGAATTCACCAGTGAGATGCAGCAGATGCA(EocRI site)；bsTRAILF2：CCGCTCGAGGCCAATTAAAAAGGCCCCAA(XhoI site)。PCR反应程序：94 ℃ 5 min，35循环(94 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min)，72 ℃ 7 min。纯化回收PCR产物。EcoRI、XhoI双酶切PCR产物与pET43.1a载体进行连接，构建pET43.1a-bsTRAIL表达载体。

1.2.5空载体pET43.1a标签蛋白及重组蛋白的体外表达及鉴定。 首先分别将pET43.1a标签(即Nus-His标签蛋白)及测序正确的连接产物转化入大肠杆菌BL21(DE3)，分别选取含pET43.1a标签及重组体的表达菌株，置于LB培养基中(加入Amp+)，37 ℃，220 r/min培养，加入IPTG至终浓度为0.2 mmol/L，16 ℃，100 r/min振荡培养24 h，分别诱导pET43.1a标签蛋白及pET43.1a-bsTRAIL蛋白的表达。超声破碎分离上清和沉淀，用镍柱亲和层析法分别获得pET43.1a标签蛋白及可溶性的pET43.1a-bsTRAIL蛋白，用SDS-PAGE跑胶鉴定，然后用1× PBS(pH8.0)对目的蛋白液进行透析。经western blotting鉴定纯化的目的蛋白。将pET43.1a标签蛋白及可溶性的pET43.1a-bsTRAIL蛋白的浓度(经测定获得pET43.1a标签蛋白浓度为1.233 mg/ml；获得pET43.1a-bsTRAIL蛋白浓度为1.015 mg/ml)按以下公式换算成μmol/L=目的蛋白浓度 / 目的蛋白的分子量(pET43.1a标签蛋白的分子量为66 kD；pET43.1a-bsTRAIL蛋白的分子量为97 kD)。

1.2.6pET43.1a-bsTRAIL蛋白生物活性测定。采用MTT法、细胞形态学观察法、台盼蓝染色法及流式细胞术对已获得的纯化重组pET43.1a-bsTRAIL(命名为重组bsTRAIL)蛋白进行生物学活性检测，并以pET43.1a蛋白作为对照。

2结果与分析

2.1bTRAIL的组织特异性分布用实时荧光定量PCR以GAPDH作为内参[15]分析bTRAIL的mRNA在不同组织中的相对表达量。SYBR Green实时荧光定量PCR分析表明bTRAIL的mRNA在心、肝、脾、肺、肾、小肠均有表达。但mRNA水平在不同组织中表达有差异(图2)。其中在脾脏中mRNA表达量最高，其次是肝脏、肾脏、小肠、心脏，表达量最低的是肺。这表明蝙蝠TRAIL在免疫系统中起重要作用。

2.2pET43.1a-bsTRAIL蛋白的表达和纯化为检测重组pET43.1a-bsTRAIL蛋白的生物学活性，重组pET43.1a-bsTRAIL蛋白表达于大肠杆菌BL21(DE3)。经SDS-PAGE检测(图2)显示，在约97 kD处为目的蛋白，经IPTG诱导24 h达到最大表达量。经Ni2+-NTA柱纯化后，收集的蛋白经SDS-PAGE分析，以抗His标签为标记的western blotting鉴定显示，纯化后的pET43.1a标签蛋白及pET43.1a-bsTRAIL蛋白能与抗鼠His单抗发生特异性反应。经测定获得pET43.1a标签蛋白浓度为1.233 mg/ml；pET43.1a-bsTRAIL蛋白浓度为1.015 mg/ml。

2.3MTT法检测重组bsTRAILMTT法测定重组pET43.1a-bsTRAIL蛋白对Jurkat与HeLa肿瘤细胞的促凋亡作用。由图3可知，在不同浓度下，重组pET43.1a-bsTRAIL蛋白表现出抑制细胞增殖的作用，这种作用呈剂量依赖性，pET43.1a蛋白作为阴性对照。

2.4Jurkat和HeLa细胞的形态观察和台盼蓝染色用4和6 μmol/L重组pET43.1a-bsTRAIL蛋白分别对Jurkat和HeLa细胞处理24、48 h后，在光学显微镜下观察pET43.1a-bsTRAIL蛋白对Jurkat和HeLa细胞作用并进行拍照以及经台盼蓝染色后拍摄的照片(图4)。由图4可知，随着时间的延长以及浓度的增加，细胞发生明显的破裂和死亡。

2.5流式细胞仪检测细胞的凋亡pET43.1a标签蛋白与重组bsTRAIL蛋白对Jurkat肿瘤细胞作用36 h后，进行流式细胞仪检测，结果见图5。由图5可知，4 μmol/L的pET43.1a标签蛋白对Jurkat细胞作用后，在凋亡区FITC(+)/PI(一)检测到少量细胞(0.6%)；4 μmol/L的重组bsTRAIL对Jurkat细胞作用后，在早起凋亡区FITC(+)/PI(一)检测到较多细胞(29.98%)，在晚期凋亡区FITC(+)/PI(+)检测到较少细胞(11.80%)；6 μmol/L的重组bsTRAIL对Jurkat细胞作用后，在晚期凋亡区FITC(+)/PI(+)检测到较多的细胞(83.41%)。

3结论与讨论

该试验成功从蝙蝠脾脏中克隆得到肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的cDNA序列，据知，目前这是通过分子克隆从翼手目哺乳动物中得到的第一个TRAIL基因。蝙蝠TRAIL(bTRAIL)CDS序列大小为843 bp，编码280个氨基酸，GenBank登录号为KF151168。预测蛋白的分子量为32.28 kD，等电点为8.11。和其他TRAIL一样，蝙蝠TRAIL具有典型的跨膜区和TNF结构域，具有N端非保守区，而C端不同物种之间具有较大的保守性。人TRAIL(hTRAIL)蛋白的Cys230通过形成分子间二硫键诱导凋亡，是TRAIL发挥重要功能所必须的，而bTRAIL也具有Cys230。bTRAIL蛋白也含有一个预测的糖基化位点和一个保守的半胱氨酸残基。在氨基酸水平上，用CLUSTAL软件分析，显示蝙蝠TRAIL和马、人、狗和牛之间的序列同源性为68%、67%、68%和63%。这表明，在哺乳动物中，TRAIL的氨基酸序列是比较保守的，且胞外区比胞内区和跨膜区更保守。实时荧光定量PCR显示，TRAIL在蝙蝠脾脏中的表达量最高，这与在人中TRAIL的分布一致。研究表明[16]，人的不可溶性TRAIL蛋白(sTRAIL)在100 ng/ml(相当于3 μmol/L的sTRAIL)处理Jurkat 和 HeLa细胞后，细胞死亡率为43%和45%，明显大于蝙蝠可溶性TRAIL蛋白对Jurkat 和HeLa细胞的作用。此差异，可能是因为蝙蝠可溶性TRAIL基因和人的sTRAIL对人TRAIL受体具有不同的结合亲和力。

为了研究重组bsTRAIL的活性，将其构建入pET43.1a表达载体。研究表明，人sTRAIL能够诱导肿瘤细胞的凋亡，因此预测重组bsTRAIL也能诱导人肿瘤细胞凋亡，因此采用人Jurkat和Hela细胞来鉴定重组bsTRAIL的活性。首先采用MTT法检测其对Jurkat和Hela细胞剂量依赖性的细胞毒理作用，结果表明重组bsTRAIL能以剂量依赖性的方式抑制细胞增殖。此外，重组bsTRAIL处理后，Jurkat和HeLa细胞的形态学观察以及台盼蓝染色后的形态学观察表明重组bsTRAIL蛋白可以以剂量依赖性的方式诱导Jurkat和HeLa细胞凋亡。为进一步验证重组bsTRAIL的细胞毒理效用，采用流式细胞术验证了重组bsTRAIL能够诱导Jurkat和HeLa细胞的凋亡。由以上结果可知，重组bsTRAIL可诱导Jurkat细胞和HeLa细胞的凋亡。但是否重组的bsTRAIL可诱发其他人类肿瘤细胞株的凋亡还有待进一步研究。

综上所述，该试验首次从翼手目哺乳动物中克隆了蝙蝠TRAIL基因，并得到其活性蛋白，结果表明重组bsTRAIL能够诱导Jurkat和Hela细胞的凋亡，这表明由于在进化上的保守性，不同物种的TRAIL蛋白之间存在交叉活性。该试验不仅有利于蝙蝠的保护工作，也为翼手目哺乳动物的生物学功能研究鉴定了基础。

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