绵阳鸡屎藤中总黄酮的提取及含量测定

绵阳鸡屎藤中总黄酮的提取及含量测定

刘晓燕，李 彬

(绵阳师范学院化学与化学工程学院，四川绵阳 621000)

摘要[目的]提取和测定绵阳鸡屎藤中总黄酮的含量。[方法]采用正交设计试验，通过醇提取法从鸡屎藤中提取出黄酮类物质，对提取黄酮类物质进行验证，用紫外可见分光光度法测定其含量。[结果]提取鸡屎藤中总黄酮的最佳工艺条件：60%的乙醇条件下用1∶30的料液比浸泡12 h后在35 ℃的条件下用超声波提取25 min，测得鸡屎藤中总黄酮的含量为1.37%，平均回收率为91.25%～100.00%。[结论]鸡屎藤叶中总黄酮含量大于鸡屎藤茎中总黄酮含量。

关键词鸡屎藤；正交试验法；总黄酮；提取；含量

中图分类号S567

作者简介刘晓燕(1965- )，女，四川德阳人，副教授，从事无机化学和环境化学研究。

收稿日期2015-06-03

Extraction and Determination of Total Flavonoids in Mianyang Chicken Excrement

LIU Xiao-yan, LI Bin(School of Chemistry and Chemical Engineering, Mianyang Normal University, Mianyang, Sichuan 621000)

Abstract[Objective] The flavonoids in the chicken excrement cane were extracted and characterized. [Method] Using orthogonal test, total flavonoids were extracted from chicken excrement cane with alcohol extraction method and the contents were determined with UV spectrophotometry. [Result] The results of orthogonal experimental indicate the optimum conditions is as follows: the optimum solvent is ethanol, the ratio of material to liquid is 1∶30, the optimum soaking time is 12 h, the optimum temperature is 35 ℃, the optimum ultrasonic extraction is 25 min. The results indicate the content of total flavonoids in chicken excrement cane is 1.37%, the average recovery is 91.25%-100.00%. [Conclusion] The content of total flavonoids in the leaves of the chicken excrement cane is more than in its root.

Key wordsChicken excrement rattan; The orthogonal test; Total flavanone; Extraction; Content

鸡屎藤属于茜草科，这种植物有一种腥腥的味道如鸡屎，是我国常见的药用植物，广泛地分布在全国各地，常生长于气候温热、肥沃、深厚、湿润的砂质壤土的溪边、河边、路边、林旁及灌木丛中，也常攀援在其他植物或岩石上，有极强的生命力，环境耐受能力极强[1-3]。因鸡屎藤化学成分比较复杂，且含有一定量的黄酮类化合物，所以它有多种药理作用[4-6]。如有较强的抗肿瘤作用，显著的消炎、抗菌、镇痛作用。此外，鸡屎藤水煎液对氧自由基有显著的清除作用。很多病理生理如炎症、肿瘤、衰老及脑缺血等均与氧自由基过多有密切联系。

对于植物提取物中总黄酮含量测定[7-14]，常采用紫外分光光度法、高效液相色谱(HPLC)法、一阶导数分光光度法和荧光法等。紫外分光光度法是测定总黄酮最常用的方法，该方法以亚硝酸钠-硝酸铝为显色剂，充分利用它们与黄酮类物质生成的红色螯合物的这一特征，在510 nm处测定其吸光度，并以芦丁为标准品进行对照，从而得到中草药中总黄酮含量。有关鸡屎藤的化学成分和营养成分的测定已经有文献报道，但对绵阳鸡屎藤黄酮含量的测定尚未见报道。笔者在此采用简单易行的紫外可见分光光度法测定其总黄酮含量，为开发、利用绵阳鸡屎藤药用提供有用的信息。

1材料与方法

1.1仪器101-2A型恒温干燥箱(上海沪南电炉烘箱厂)；KQ-300E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；T6新世纪紫外分光光度仪(北京普析通用仪器有限责任公司)；微型高速万能试样粉粹机(湖北省黄骅新兴电器厂)；SHD-2000型循环水式多用真空泵(河南巩义市英予华仪器厂)。

1.2试剂鸡屎藤草(6月采自绵阳游仙区)；芦丁标准品(中国药品生物制品检定所)；95%乙醇、无水乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、石油醚，均为AR，成都市科龙化工试剂厂。

1.3试验方法 摘新鲜鸡屎藤茎、叶(绵阳市游仙区)→阳光下晾晒备用→茎、叶分离→茎、叶烘干(60 ℃)→粉碎→称量→溶剂浸泡12 h(乙醇浓度、料比)→超声波处理(温度、时间)→减压抽滤→石油醚萃取→浓缩定容→稀释→测定吸光度值→计算鸡屎藤中总黄酮含量。

1.3.1芦丁标准溶液的配制。准确称取10 mg芦丁标准样品到25 ml小烧杯中，加入少量的30%乙醇溶液，使标准样品部分的溶解，将溶解的样液转至100 ml容量瓶中，继续加入少量的30%乙醇溶液使小烧杯中的固体样品全部溶解，转入100 ml的容量瓶中，进行旋摇使其充分溶解，直至容量瓶中溶液完全澄清。加30%乙醇溶液定容至100 ml，即得到0.1 g/L的芦丁标准溶液。

1.3.2建立标准曲线。分别吸取“1.3.1”芦丁标准溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5于25 ml比色管中，加入0.7 ml 5%亚硝酸钠溶液混合均匀，静置7 min后再加入0.7 ml 10%硝酸铝溶液混合均匀并静置7 min后，继续加入5 ml 1 mol/L的氢氧化钠溶液，摇匀后用30%乙醇溶液定容至刻度线，再充分摇匀，静置15 min，用紫外分光光度仪在波长为510 nm处比色测定出各样品溶液的吸光度，试剂空白为参比液，在平行处理的条件下测定3次，求其平均值。

1.3.3正交试验设计。 以提取溶剂系统即乙醇浓度、溶剂系统的料液比、超声波处理温度、超声波处理时间作为影响提取物鸡屎藤中总黄酮含量的4个主要因素，乙醇浓度取4个水平，溶剂系统的料液比、超声波处理温度、超声波处理时间分别取3个水平，选用L943正交试验表安排试验，共108组，其中乙醇浓度为95%、80%、60%、0%，料液比为1∶10、1∶20、1∶30，超声波处理时温度为25、30、35 ℃，超声波处理时间为15、25、35 min；超声波处理功率100 W。称取粉碎后的鸡屎藤茎、叶各2 g，加入4种不同的溶剂系统、3种不同系统的料液比，平行操作条件下，在常温下密封静置浸泡12 h，分别在25、30、35 ℃不同温度下进行15、25、35 min不同时间的超声波处理，使其更加充分地提取出鸡屎藤中的总黄酮，减压抽滤后，用少量的石油醚萃取3次，萃取液在恒温水箱中浓缩至20～40 ml后，在室温下冷却，冷却后转移至50 ml的容量瓶，用30%乙醇溶液定容至50 ml，再移取1 ml待测液于25 ml比色管中，加入0.7 ml 5%亚硝酸钠混合均匀，静置7 min后加入0.7 ml 10%硝酸铝混合均匀并静置7 min后，再加入5 ml 1 mol/L的氢氧化钠，摇匀并用30%乙醇溶液定容至刻度后，充分摇匀后，静置15 min，用紫外可见分光光度仪在波长为510 nm处比色测定出各待测溶液的吸光度，试剂空白为参比液，在平行处理的条件下测定3次，求其平均值，并计算总黄酮的含量。

2结果与分析

2.1芦丁标准曲线的建立以芦丁样品溶液作为横坐标、吸光度作为纵坐标，绘制出标准曲线(图1)。用最小二乘法进行线性回归分析得出标准回归方程为Y=12.543X+0.000 3(R2=0.999 9)。

2.2正交试验

2.2.1溶剂系统的优化。鸡屎藤中有效成分的提取常用乙醇、水等溶剂，不同溶剂对鸡屎藤有效成分的提取有较大影响，由图2可知，60%的乙醇水溶液对提取鸡屎藤中总黄酮效果最佳，用乙醇溶剂不仅可以提取出黄酮苷元还可以提取黄酮苷，提取的产率更高；而用水作提取液，过滤十分的缓慢，对试验有较大的影响。

2.2.2料液比的优化。在正交设计试验条件下，通过改变不同料液比来提取鸡屎藤中总黄酮含量的分析，从图3可看出，在1∶10、1∶20、1∶30的料液体条件下，提取鸡屎藤中总黄酮含量最佳料液比为1∶30。

2.2.3超声温度的优化。在正交设计试验的条件下，通过对超声温度的控制，超声波在25、30、35 ℃的条件下，经过35 ℃处理后鸡屎藤提取液总黄酮含量高(图4)，由此可以得出提取鸡屎藤中总黄酮含量超声波温度在35 ℃下效果最佳。

2.2.4超声时间的优化。在试验优化的条件下，以最佳溶剂60%乙醇、最佳料液比1∶30、最佳超声温度35 ℃的条件下，平行测定出稀释溶液的吸光度，根据试验稀释倍数计算出体积浓度，从图5可以得出，超声波最佳时间为25min。

2.3提取物的分析

2.3.1提取物的定性分析。

2.3.1.1紫外可见分光光谱分析。黄酮类的化合物大部分均具有C6-C3-C6的基本结构，在240～400nm紫外光谱下大多数黄酮类化合物具有2个吸收峰，在320～380nm光谱带Ⅰ是由B环取代基性质决定，240～270nm光谱带Ⅱ是由环取代基性质决定的。芦丁标准溶液在经过加入亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠显色处理后带Ⅰ和带Ⅱ转移至450～510和415～470nm处，而在510nm左右所提取的样品图谱(图6b)的吸收峰与芦丁标准溶液图谱(图6a)相似。

2.3.1.2显色反应。黄酮类化合物的基本碳架上常含有碱性氧原子，它的绝大多数均带有酚羟基的衍生物，因此能够与金属离子发生络合反应和与较强的还原性试剂发生颜色反应。根据黄酮类化合物的这些特性可以对样品进行定性鉴定，结果表明鸡屎藤里含有黄酮类物质(表1)。

2.3.2鸡屎藤茎、叶中总黄酮含量测定。在试验优化的条件下，以最佳溶剂60%乙醇、最佳料液比1∶30、最佳超声温度35 ℃、最佳超声波时间25min的条件下，平行测定出稀释溶液的吸光度，根据试验稀释倍数计算出体积浓度。从表2～3可看出，鸡屎藤叶中的总黄酮含量大于鸡屎藤茎中的总黄酮含量。

表1　样品颜色反应现象

表2　最佳条件下鸡屎藤叶中总黄酮含量

表3　最佳条件下鸡屎藤茎中总黄酮含量

2.3.3加标回收试验。分别取处理过的样品(鸡屎藤茎和叶)各一份，并加入一定量芦丁标准溶液，按“2.3.2”样品测定步骤进行回收试验。结果表明(表4～5)，鸡屎藤茎的平均回收率为91.25%～100.00%，鸡屎藤叶为95%～100%，RSD分别为3.7%、2.0%。说明这种方法测定鸡屎藤茎和叶中的黄酮含量准确可靠，也符合定量分析要求。

表4　鸡屎藤茎的加标回收

3结论

通过正交试验采用超声波辅助醇提取法从鸡屎藤中提取黄酮类物质，得出醇提取鸡屎藤中黄酮类化合物最佳试验条件，根据最佳试验条件提取鸡屎藤中黄酮类物质，对所提取的黄酮类物质进行光谱扫描、显色反应等表征，用紫外分光光度法测定其含量。结果表明，提取鸡屎藤总黄酮的最佳试验条件：60%乙醇在1∶30的料液比下温度为35 ℃的超声波下提取25min，测得鸡屎藤中总黄酮的含量为1.37%，平均回收率为91.25%～100.00%。总之，超声波辅助醇提取

表5　鸡屎藤叶的加标回收

法是一种全物理的方法，成本低、高效、无任何污染，是一条理想的提取黄酮类物质的途径，为鸡屎藤的利用和开发提供一定的参考。

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