无创产前基因检测在产科门诊的应用研究

徐 彬余元勋章小琳李建平刘 萍

◇生育与妇幼卫生◇

无创产前基因检测在产科门诊的应用研究

徐 彬1余元勋1章小琳2李建平1刘 萍1

目的：应用新的基因DNA测序方法研究其对孕中期孕母血浆中胎儿游离DNA（cffDNA）进行染色体非整倍体检测的灵敏度和特异性，并与羊水核型分析结果比较。方法：收集2013年1月～2014年7月在安徽省立医院产科门诊2596例孕妇的血样本，进行唐氏综合症血清学筛查、12-plex高通量Hiseq2000平台检查；对血清学筛査中的cffDNA检测阳性者，进行羊水细胞遗传学诊断。结果：孕中期血清学筛查共2596例，发现高危孕妇197例，占7.59%；对高危孕妇176例进行cffDNA检测发现43例阳性，阳性率为24.43%；同时进行羊水染色体核型分析发现42例核型异常，阳性率为23.86%；两种方法结果基本一致。结论：孕妇血的胎儿cffDNA检测，是无创产前诊断方法；检测灵敏度较高。

无创性产前诊断 唐氏综合症 胎儿游离DNA 核型

唐氏综合征（Down syndrome,DS）又称21-三体（Trisomy 21，T21）综合征、先天愚型,是最常见的染色体非整倍体疾病，新生儿发病率在1/700～1/800，占新生儿染色体病的70%～80%[1],其他比较常见的还包括18-三体（Trisomy18，T18）、13-三体（Trisomy13，T13）、Turner综合症等。目前简便、经济、无创的孕中期血清学标志物筛查，是检测胎儿染色体非整倍体疾病的重要筛查手段。研究表明，血清学标志物筛查的假阳性率较高（5%～7.5%）[2]。因此应用更好的方法产前发现这些染色体疾病胎儿,能有效减少患儿的出生,是当前围产优生学的重要任务之一。

1997年Lo等报道，母血中存在胎儿游离DNA（cffDNA），可进行无创诊断胎儿染色体异常，即仅抽取母血，对血中cffDNA进行测序，即可诊断胎儿是否为染色体异常[3]；2008年Lo等先后报道，使用对血中cffDNA测序、进行无创产前检测（NIPT）时，T21的检测准确度为100%[4]。随后多项临床研究证实，使用对血中cffDNA测序，检测T21、T18、T13的灵敏度、特异度及阴性预测值（NPV）均较高[5～6],适用于产前诊断，目前已成为常用方法。本文通过血清学筛查、cffDNA测序检测，诊断染色体异常，能为该方法在安徽大规模临床研究和应用，提供循证医学证据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择2013年1月～2014年7月安徽省立医院产科门诊孕期产检的2596例孕妇，年龄22～44岁，孕11～24周，采取血样本者均有知情同意书，本研究经过该医院的伦理委员会审批通过。入组条件:＞孕11周;单胎妊娠;体重在100kg以下。排除条件:多胎妊娠;孕妇是染色体异常患者;孕妇在抽血当天有侵入性手术经历;孕妇接受过异体输血、移植手术、干细胞治疗等;拒绝行cffDNA检测者。

1.2 方法 常规抽取静脉血3～5ml,血液凝固后分离血清，将血清装入血清保存管,4℃保存，注明标本编号。血清于1周内在安徽省立医院检验科完成TRAFIA法检测AFP、Free-βHCG、uE3的血清浓度；剩余血清-20℃保存。实验过程严格按照说明书操作，并有质控。研究中保证孕妇临床资料信息准确，孕周正确估计。孕早期超声孕周核对应以头臀长作为标准，孕中期核对时应以双顶径作为标准。

1.2.1 按文献[6]进行cffDNA检测标本采集 应用孕妇血浆样本采集标准作业程序（SOP），采集孕妇外周血10ml，一般置于数个标准真空采血管内（EDTA抗凝），充分混匀，在抽血后6小时内进行以下处理：在4℃下两次离心10min，将上清血浆转入新的1.5ml离心管中，-80℃保存。

1.2.2 按文献[6]进行DNA标本的SOP 血浆样本DNA抽提（磁珠分离法）时，先用1ml血浆，加2ml binding buffer;70μl（20μg/μl）蛋白酶K;120μl（1μg/μl）carrier RNA;15μl（10μg/μl） 糖原; 30μlBEADS;室温下混匀 15～20min；分装到1.5mlEP管中，静置1～2min，吸去废液;加入40μl EB液，55℃水浴10min（每30s混匀一次）；静置1～2min，收集液体至新的EP管中。Qubit定量样品DNA浓度。按文献[6]进行DNA末端修整、末端加A、连接。

1.2.3 PCR与测序、羊水细胞培养染色体核型分析 配制如下反应体系，含DNA液22 μl、PhusionDNA polymerase25μl、PCR primer1.0μl、PCR primer2.0μl；总体积50μl。反应条件:98℃30 s热变性;再98℃10 s，65℃30 s，72℃30 s，15个循环;延长72℃10 min。按照QIAquick PCR purification kit说明，柱纯化DNA。Qubit定量DNA浓度。使用12-plex高通量Hiseq2000平台进行高通量测序。运用序列比对软件BWA map，将DNA测序所得的cffDNA序列，比对于人类基因组参考序列。计算每条染色体所占比例（%），并利用公式计算各个染色体Z值。利用Z值来评估样本的实际患病情况（cut off:Z=3）。按文献[6]进行羊水细胞培养染色体核型分析。

1.3 统计学方法 本研究所有的研究数据均使用Microsoft Office Excel 2007进行录入和统计。用SPSS13.0统计软件进行统计学处理。计量资料用平均数±标准差表示，用方差分析检验，计数资料用卡方检验。P＜0.05为差异存在统计学意义。

2 结果

2.1 孕妇一般情况分析 本次共收入2596例单胎妊娠孕妇进行研究分析，年龄22～44岁，平均年龄32.28±3.72岁。2509例（96.45%）为低龄组（≤35岁），平均年龄（28.83±2.407）岁。87例（3.35%）为高龄组（＞35岁），平均年龄（38.13±2.02）岁。采血样孕周为11～24周，平均（16±3）周；1768例（68.10%）为首次妊娠；2171例（83.63%）为首次生育；208例（8.01%）有流产史。

2.2 血清学筛查结果 血清学筛査2596例后，发现高危患者共197例，阳性率7.59%，不同年龄孕妇血清学筛查的DS高风险率分布情况见表1；C、D年龄组与A、B年龄组间DS高风险发生率差异有统计学意义（P＜0.05）。随着高龄孕妇的增加，唐氏综合症筛查的阳性率也增加，高龄组DS风险更高。

表1 不同年龄组孕妇血清学筛查DS高风险率分布情况

2.3 cffDNA检测结果 共收集高危孕妇样本176例，cffDNA检测43例阳性：28例T21;5例T18;1例T13;4例45，XO；3例45，X；2例47，XXY，总体阳性率为24.43%（43/176）。

2.4 羊水染色体核型分析结果 血清学筛查后共收集高危孕妇经腹羊膜腔穿刺羊水样本176例，进行细胞培养染色体核型分析；其中染色体核型异常阳性共42例，阳性率23.86%（42/176），包括 27例 T21;5例 T18;1例 T13;4例 45，XO;3例45，X;2例47，XXY，胎儿染色体核型分析结果与cffDNA检测结果基本一致；无创产前基因检测与染色体核型分析准确率的比较见表2。

表2 无创产前基因检测与染色体核型分析准确率的比较

3 讨 论

过去诊断胎儿染色体非整倍体疾病，常通过侵入性产前诊断操作，如绒毛活检、羊膜腔穿刺而获得样本。由于侵入性操作可带来流产风险，而利用血清学生物标记物、超声等对普通妊娠人群进行筛查，筛选出高危人群进行产前染色体确诊，显得尤为重要；但是筛查后，约3%～5%的人群仍需进行侵入性操作取样[7]。许多研究表明，血浆cffDNA检测不受孕周与年龄的限制，为无创产前诊断的较优方法。用孕母血浆cffDNA检测胎儿非整倍体，尤其是T21时，有较高的敏感性和特异性[6]。本研究选择普通孕妇作为研究人群，应用第二代DNA测序技术对孕母血浆中cffDNA进行无创胎儿染色体非整倍体检测，同时平行进行羊水染色体核型分析。

2011年有人发表了一系列研究cffDNA检测的结果，发现用cffDNA法对胎儿非整倍体产前检测的效率较高。Ehrich M等[8]对孕母血浆cffDNA进行无创胎儿T21检测，共检测480例高危者，结果显示，对T21检测的灵敏度为100%，特异性为99.7%。Chiu RW等[9]发现，对胎儿T21高风险孕妇血浆进行cffDNA检测时较有效、可行。2012年Palomaki GE等[6]对DNA GC含量进行校正后，采用第二代DNA测序方法，对孕母血浆检测cffDNA，对 T18和 T13检出率分别为 100%和91.7%，假阳性率分别为0.28%和0.97%；这一方法可使侵入性产前诊断操作率降低95%。ACOG在美国进行了一项多中心研究，前瞻性研究评价cffDNA法对孕母血浆胎儿非整倍体诊断的准确性[10]，结果较好。

本研究在安徽省立医院产科门诊采集2596例孕妇的血样本，血清学筛查高危者共197例，结果阳性率为7.59%。高/低龄组间DS高风险发生率差异有统计学意义，随着高龄孕妇的增加，唐氏综合症筛查阳性率也增加，高龄组DS高风险发生率较高。研究中共收集高危者样本176例，检测cffDNA后检出43例阳性：28例T21；5例T18；1例T13；4例45，XO；3例45，X；2例47，XXY，总阳性率为24.43%；经羊水细胞染色体核型分析证实的染色体非整倍体异常共42例，总阳性率为23.86%;两种方法结果基本一致，P＞0.05。

本研究应用第二代DNA测序技术对孕母血浆中cffDNA进行无创胎儿染色体非整倍体检测，显示了较高的灵敏度和特异性，初步证明cffDNA产前检测技术可以检测常染色体与性染色体等，产前检测效率较高，质量控制较简单，无年龄依赖性和孕周依赖性，可避免大量不必要的侵入性产前诊断操作；应用于孕中期产前筛查时方法可行，但仍需进一步大样本研究。

1 中华人民共和国卫生行业标准：胎儿常见染色体异常与开放性神经管缺陷的产前筛查与诊断技术标准，第1部分:孕中期母血清产前筛查[S]．北京，中国标准出版社，2010：1～9．

2 杨灿锋，王峻峰，朱云霞，等．15230例孕中期唐氏筛查产前诊断的临床应用价值[J]．实用妇产科杂志，2011，27（2）:142～145．

3 Dennis LY．Prenatal diagnosis：progress through plasmanucleicacids[J]．NatRevGenet，2007，8（1）:71～77．

4 Lo YMD，Chiu RWK．Genomic analysis offetal nucleic acids in maternal blood[J]．Annual Review of Genomics and Human Genetics，2012，13:308～316．

5 Sparks AB，Wang ET，Struble CA．Selective analysis of cell-free DNA in maternal blood forevaluation of fetal trisomy[J]．Prenat Diagn，2012，32（1）:3～9．

6 Palomaki GE，Deciu C，Kloza EM．DNA sequencing of maternal plasma reliably identifies trisomy 18 and trisomy 13 as well as Down syndrome:an international collaborativestudy[J]．GenetMed，2012，14(3):296～305．

7 Kagan KO，Cicero S，Staboulidou I．Fetal nasal bone in screening fortrisomies 21，18 and 13and Turner syndrome at 11-13 weeks of gestation[J]．Ultrasound Obstet Gynecol，2009，33(3)：259～264．

8 Ehrich M，Deciu C，Zwiefelhofer T．Noninvasive detection of fetal trisomy 21 by sequencing of DNA in maternal blood:a study in a clinical setting[J]．Am J Obstet Gynecol，2011，204(3)：201～205．

9 Chiu RW，Akolekar R，Zheng YW．Non-invasive prenatalassessmentoftrisomy 21 bymultiplexed maternal plasma DNA sequencing:large scale validity study[J]．BMJ，2011，342：7401～7409．

10 Bianchi DW，Piatt LD，Goldberg JD．Genome-wide fetal aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing[J]．Obstet Gynecol，2012，119(5):890～899．

Applicativeresearchofnoninvasiveprenatalgenecheckingintheobstetricalclinics

1.Anhui Medical College,Anhui Provice Medical Genetics Center,Hefei 230061,Anhui 2.Anhui Provincial Hospital,Hefei 230001,Anhui XU Bin1,YU Yuan-xun1,ZHANG Xiao-lin2,et al

Objective:To study the sensitivity and specificity of using new gene DNA sequencing method to check the cffDNA in their mother's plasma for the chromosome abnormality,and to compare the results with the results of amniotic fluids karyotyping.Methods:The bloods of 2596 pregnant women from the clinic of the Anhui Province Hospital from January 2013 to July 2014 were screened applying DS serelogical screening method,12-plex high rate Hiseq 2000 checking,we found the cffDNA positive samples that were analyzed by amniotic fluids karyotyping again.Results:From the 2596 pregnant women,we found 197 high riskers（7.59%）,from 176 high riskers were cffDNA positive（24.43%）,from 176 high riskers,we found that 42 high riskers were abnormal karyotype（23.86%）,The two methods can get nearly same result.Conclusion:Checking the cffDNA from their mother's plasmas is the noninvasive prenatal diagnostic method with high sensitivity.

Noninvasive prenatal diagnosis；Down's syndrome;cffDNA;Kryotype

R473．71

A

1671-8054（2015）06-0089-03

/（编审：吴大保 施仲赋）

1.安徽医学高等专科学校安徽省遗传医学中心 合肥 230061 2.安徽省立医院产科 合肥 230001

安徽高校省级自然科学研究项目（编号：KJ2014A128）

徐彬，男，副研究员

2015-10-07收稿，2015-11-13修回