微波辅助提取红芪多糖*

赵保堂，寇宁，汪月，冯丽丹

1(甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州，730070)2(兰州大学基础医学院，甘肃 兰州，730000)

红芪为豆科植物多序岩黄芪(Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz.)的干燥根，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿等功效。红芪多糖(HPS)是红芪的主要活性成分之一，可作为中医常用传统药物在恶性肿瘤及各种退行性疾病的临床治疗与康复中用量较大［1］。李晓东等人发现，HPS-3能降低血糖，对T2DM大鼠的糖脂代谢紊乱有一定的调节作用，能促进T2DM大鼠肝糖原的合成，修复受损的胰岛β细胞，减轻T2DM 大鼠胰岛素抵抗［2］。金智生等的研究表明，HPS能明显降低糖尿病大鼠血糖，能抑制TC、TG、LDL-C升高，抑制 HDL-C降低，从而降低血糖和调节血脂代谢减轻糖尿病大鼠病情和延缓其并发症的出现［3］。杨涛等人采用细胞溶血法对HPS的抗补体活性进行研究结果表明，HPS具有一定程度的抗补体活性［4］。多糖的提取是研究其结构与活性的基础，选择合适的提取方法、最佳的提取工艺，不仅可以有效的提取多糖，而且能够最大限度的保持活性。魏舒畅等人利用酶解提取红芪总多糖的研究发现，酶用量、酶解时间、酶解温度、溶剂pH值、溶剂用量、提取时间等参数的选择会影响活性成分的提取［5］。王宗元等采用单因素确定了热水浸提红芪多糖的最佳工艺温度80℃，浸提次数3次，浸提时间110 h，液料比 1∶12 时，红芪多糖的提取率较高［6］。胡燕等通过正交实验法优化了超声波法提取红芪多糖的工艺，结果表明超声温度80℃，超声时间30 min，超声功率128 W，料液比1∶30(g∶mL)，红芪多糖含量在7.8%左右［7］。刘宝剑等通过比较常规法和微波-超声波提取红芪多糖发现，常规法得多糖含量为4.19%，微波-超声波法得多糖含量为8.98%［8］。

本文采用微波辅助提取法［9］对红芪多糖进行提取，并优化工艺参数。

1 材料、试剂与仪器

1.1 材料、试剂

红芪，购自甘肃武都。

DPPH，Solarbio公司;FeSO4，天津恒兴化学试剂制造有限公司;3，5-二硝基水杨酸，天津市华新化工有限公司;吩嗪硫酸甲酯(PMS)，还原型辅酶 I(NADH)，氯化氮蓝四唑，Solarbio公司;乙醇，白银良友化学试剂有限公司;FeCl2，天津市金铂兰精细化工有限公司;FeCl3，天津市宽忠精细化工厂;H2O2，淮南市凌天精细化工有限公司;K3Fe(CN)6，天津金汇太亚化学试剂有限公司。

1.2 实验仪器

电子天平(BL320H)，北京赛多利斯天平有限公司;紫外可见分光光度计(Labtech UV1000)，北京莱伯泰科仪器有限公司;集热式恒温磁力搅拌器(DF-101B)，科瑞仪器有限公司;型微波提取设备(NJC03-2)，上海必尔得仪器实业有限公司;恒温水浴锅(JRA-6)，金坛市杰瑞尔电器有限公司;旋转蒸发器(RE-52A)，上海亚荣生化仪器厂;循环水式多用真空泵(SHB-III，)上海亚荣生化仪器厂;冷冻干燥机(LGJ-18S)，郑州长城科工贸有限公司;台式大容量冷冻离心机(TDL5M)，北京松源华兴科技发展有限公司。

2 实验方法

2.1 微波辅助提取红芪多糖

准确称取一定量预处理后的红芪干燥根粉末，以蒸馏水为溶剂，采用不同液料比、微波功率、提取温度、提取时间、提取次数在恒温水浴中进行红芪多糖的提取试验。提取液经过离心后减压浓缩至较小体积，加入无水乙醇至终浓度为85%，醇沉24 h后离心，下层沉淀用无水乙醇、丙酮洗涤多次，经冷冻干燥得到红芪多糖，具体工艺如提取流程图所示(图1)，多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法［7-8］。

图1 红芪多糖微波辅助提取工艺流程Fig.1 The process flow diagram of polysaccharide from fruit of Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz by microwave-assitant extration

2.2 红外光谱表征(FT-IR)

充分干燥的样品与KBr压片，用Thermo Nicolet iS10红外光谱仪在400～4 000 cm-1内扫描，扫描次数16次，分辨率4 cm-1。

2.3 分子质量测定

采用体积排阻色谱(GPC)测定分子质量。红芪多糖样品用去离子水配成所需浓度的溶液，用微孔滤膜过滤，在690 nm波长下用GPC测定。进样量200 μL，流速为0.5 mL/min，温度为25℃。

2.4 实验设计与统计分析

影响微波辅助提取红芪多糖含量的主要因素有微波作用时间、液料比、温度、微波功率和提取次数。在单因素实验基础上，利用Box-Behnken的中心组合试验设计原理进行实验设计，优化微波辅助提取红芪多糖的影响因素，评价影响多糖含量因素的主效应、相互效应及因素的二次效应关素(表1)。根据BBD设计原理，选择单因素试验中对响应值(多糖含量)有显著影响的因素:时间、温度、功率、液料比作为自变量，进行4因素3水平的29组实验(表2)。通过方差分析，计算一次项、二次项与交互影响项的回归系数。然后，利用回归系数建立曲面和等高线模型。采用SAS8.0统计软件分析实验数据，当P＜0.05，表示有显著差异。

表1 实验因素、水平及编码Table 1 Independent variables and their levels used in the response surface design

2.5 对DPPH自由基的清除作用

精确称取BHT与多糖样品，用蒸馏水配制成浓度为0.04、0.06、0.1、0.4、0.6、1、3、5 mg/mL 的溶液，充分摇匀，备用。准确量取1 mL不同浓度的多糖溶液或BHT溶液，分别加入2 mL现配的浓度为0.2 mmol/L的DPPH溶液，旋涡混匀器混匀后，置于暗处30 min，以蒸馏水为空白调零，在517 nm处测定吸光值，得Ai值;用蒸馏水代替样品，测定A0;用蒸馏水代替DPPH溶液，测定Aj;反应物的吸光值越小，表明多糖对DPPH自由基的清除能力越强。根据以下公式计算DPPH自由基的清除率:

每个样品重复3次，求平均值。

2.6 对羟自由基(·OH)的清除作用

精确称取一定量的抗坏血酸(VC)与多糖样品，用蒸馏水配制成浓度为 0.04、0.06、0.1、0.4、0.6、1、3、5 mg/mL的溶液，充分摇匀，备用。分别量取不同浓度的多糖溶液、VC溶液各0.1 mL，依次加入反应液(20 mmol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液，2.67 mmol/L脱氧核糖，100 mmol/L EDTA)0.6 mL、0.4 mmol/L 的 FeSO4胺溶液0.2 mL、10 mmol/L H2O2溶液0.2 mL，在37 ℃水浴加热15 min，再分别加入1%丙二酰硫脲溶液和2%的三氯乙酸溶液各1 mL，终止反应，然后沸水浴加热15 mim后冷却至室温，以蒸馏水为空白调零，在532 nm下测定吸光值，得Ai，用蒸馏水代替样品，测定A0，根据以下公式计算羟自由基(·OH)清除率:

每个样品重复3次，求平均值。

2.7 对超氧阴离子(·O2-)的清除作用

精确称取一定量的抗坏血酸(VC)与多糖样品，用蒸馏水配制成浓度为 0.04、0.06、0.1、0.4、0.6、1、3、5 mg/mL的溶液，充分摇匀，备用。采用吩嗪硫酸甲酯(PMS)-还原型辅酶 I(NADH)-氯化氮蓝四唑(NBT)体系产生超氧阴离子自由基。分别量取不同浓度的多糖溶液、VC溶液各1 mL，依次加入用 pH 8.0、浓度为16 mmol/L的Tris-HCl缓冲液配制的浓度为 557 μmol/L NADH-2Na、浓度为 45 μmol/L PMS及浓度为108 μmol/L NBT各1 mL，旋涡混匀器混匀后，在室温静置5 min，用蒸馏水调零，在560 nm下测吸光值Ai，以蒸馏水代替多糖溶液，测定A0，根据以下公式计算超氧阴离子(·O2-)清除率:

每个样品重复3次，求平均值。

2.8 还原力

精确称取一定量的抗坏血酸(VC)，用蒸馏水配制成浓度为 0.04、0.06、0.1、0.4、0.6、1、3、5 mg/mL的溶液，充分摇匀，作为对照品备用。分别量取不同浓度的多糖溶液、VC溶液各1 mL，依次加入磷酸缓冲液(pH 6.6)和K3Fe(CN)6溶液各2.5 mL，混匀后50℃水浴20 min，然后加入质量分数10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，混匀，1 000 r/min离心10 min，取上清液2.5 mL，再加入蒸馏水和质量分数0.1%的FeCl3各2.5 mL，混匀，静置10 min，蒸馏水调零，在700 nm处测定吸光值，每个样品重复3次，以700 nm吸光值的平均数表示还原力的高低。

3 结果与讨论

3.1 单因素实验结果

3.1.1 时间对HPS多糖含量的影响

在液料比30∶1(mL∶g)，提取温度80℃，提取次数2次，微波功率200 W的条件下，考察微波作用时间(5、10、15、30、45、60、75、90 min)对红芪多糖含量的影响，结果如图2所示。

图2 时间对红芪多糖含量的影响Fig.2 Effects of different time on total carbohydrate content of HPS

从图2可以看出，随着微波作用时间从5 min增加至30 min，HPS的含量呈明显增加趋势，两者呈正相关;当微波作用时间超过30 min后，HPS含量未有明显增加。这是由于微波辐射造成分子运动加速，使得红芪中的多糖成分很快释放到溶液中，当到达一定时间后，植物细胞内膜内外的渗透浓度逐渐相等，多糖含量也不再明显增加。因此，选择30 min作为HPS的提取时间。

3.1.2 温度对HPS多糖含量的影响

在液料比30∶1(mL∶g)，微波作用时间30 min，微波功率200 W，提取次数2次的条件下，考察提取温度(45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃)对红芪多糖含量的影响，结果如图3所示。

图3 温度对红芪多糖含量的影响Fig.3 Effects of different temperature on total carbohydrate content of HPS

由图3可知，在45～75℃内，HPS的多糖含量与温度呈正相关，随着温度的升高，HPS的含量也逐渐升高;当温度超过75℃，随着温度的升高，HPS的多糖含量不再有明显升高。这主要归因于，高温会增加多糖在水中的溶解度，从而使多糖含量升高，但高温同时会造成多糖的水解，从而使其多糖含量下降。说因此，对HPS的提取，70～85℃是一个比较好的温度范围。

3.1.3 液料比对HPS多糖含量的影响

在微波作用时间30 min，提取次数2次，微波功率200 W，提取温度75℃的条件下，考察液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，mL∶g)对红芪多糖含量的影响，结果如图4。由图4可知，随着液料比的增加，HPS的多糖含量逐渐趋于平衡。这种现象的出现，HPS做为红芪可溶性成分，增大溶剂比例，有利于最大限度的溶解这些成分，而过多的溶剂，为后续处理带来很多不便。因此，基于节能的考虑，选择20∶1的液料比，对HPS的提取最为经济。

图4 液料比对红芪多糖含量的影响Fig.4 Effects of different ratios of water to raw material on total carbohydrate content ofHPS

3.1.4 微波功率对HPS多糖含量的影响

在微波作用时间30 min，提取次数1次，提取温度75℃，液料比为25∶1(mL∶g)的条件下，考察微波功率(50、100、150、200、250、300、350、400 W)对红芪多糖含量的影响，由图5可知，在100～300 W内，红芪多糖含量随微波功率的增加而增大，但是当功率大于300 W时，多糖含量升高趋于平衡。这是因为，在不同功率下，细胞内温度升高使细胞内部压力升高不同，细胞破裂程度不同，细胞内的物质流出量也不同;功率增加使细胞内的温度急剧增加，高温使得总糖中的某些成分结构破坏、损失。因此选择300 W做为微波辅助提取的功率。

图5 微波功率对红芪多糖含量的影响Fig.5 Effect ofmicrowave power on total carbohydrate content of HPS

3.1.5 液料比对HPS多糖含量的影响

在微波作用时间30 min，液料比25∶1(mL∶g)，提取温度75℃，微波功率300 W的条件下，考察提取次数(1次、2次、3次、4次、5次)对红芪多糖含量的影响，结果如图6。

图6 提取次数对红芪多糖含量的影响Fig.6 Effects of different extraction times on total carbohydrate content of HPS

由图6可知，提取次数与HPS的多糖含量呈正相关，随提取次数的增加而升高，但升高不明显。主要是由于HPS在第1次提取时已经基本浸出，后续提取中虽然HPS的含量略有升高，但同时增加提取次数，费时费力。因此，在HPS的微波辅助提取中，只选择提取1次较为理想。

3.2 回归模型的建立与分析

为了考察对HPS含量影响最大的因素，以时间、温度、微波功率、液料比作为自变量，HPS含量(Y)作为响应值的29组BBD实验(表2)。结果表明，HPS含量为5.93%～10.45%。

表2 Box-Behnken试验设计及结果Table 2 Operating parameters as well as the experimental and predicted values of extraction yields of polysaccharides for different setups of experimental design

通过SAS数据分析软件对表2中数据进行处理，得到回归模型的方差分析结果(表3)以及多元二次回归方程模型(不带编码):

表3 回归模型的方差分析结果Table 3 The results of variance analysis of regression mode

回归方差分析显著性检验(表3)表明，模型P小于0.000 1，说明该模型回归显著，并且该模型的R2=0.98，说明该模型与实际实验拟合较好，自变量与响应值之间线性关系显著，可以用于红芪多糖微波辅助提取工艺的理论预测。回归方程各项的方差分析结果还表明方程的一次项 (X1，X2，X3，X4)均小于0.05，说明各因素一次项对HPS含量的影响极显著，其中 X2，X3，X4对含量影响极显著;交互影响项(X1X3，X2X3，X2X4，X3X4)对HPS含量影响也极显著，其中X1X3，X2X3，X2X4对其影响极显著;二次项(X12，X22，X32，X42)对HPS含量影响也极显著。因此各个具体实验因子对响应值的影响不是简单的线性关系。根据系数估计值可知各因素的主效应关系是:液料比＞功率＞温度＞时间。

图7～图12是根据多元回归方程所得到的不同处理因素对红芪多糖含量影响的响应面图，通过该组图可对任意两因素及其交互作用对红芪多糖得率的效应进行分析和评价，并从中确定最佳因素水平范围。研究表明，等高线的形状可反映出交互效应的强弱，越趋向椭圆表明交互作用越强，越趋向圆形则相反，表明交互作用越弱。

图7是提取时间与微波功率对HPS多糖含量的交互影响图。由图7可知，随着提取时间的延长，HPS的多糖含量呈先增后减的趋势，而微波功率对HPS的多糖含量的影响不明显。HPS的多糖含量在30～50 min内，随时间的延长而升高，而超过50 min，HPS的多糖含量随时间延长而呈下降趋势。

图8是提取时间与温度对HPS含量的交互影响图。由图8可知，HPS的多糖含量随提取时间与温度增大而呈现先增后减的趋势，在42 min，80℃时达到一个域值。

图8 时间与温度交互作用对HPS含量的交互影响图Fig.8 Effects of time and temperature on the content of HPS

图9是时间与液料比对HPS多糖含量的交互影响图。由图9可知，HPS的多糖含量随时间增大而呈先上升后下降的趋势。在30～48 min，随提取时间的增加，HPS的多糖含量也增加，超过48 min，HPS的多糖含量随提取时间的增加而降低。这与图7一样，可能是由于过长时间会造成HPS的水解导致的。同时，在液料比低于24∶1时，HPS的多糖含量随液料比的增大而增大，当液料比超过24∶1时，HPS的多糖含量基本呈平衡趋势。这是由于溶质HPS在水中的溶解度一定，在水中的溶解的量先随溶剂的量的增加而增大，在24∶1时达到一个平衡，当超过这个量时，随着液料比的逐渐增大，多糖含量呈下降趋势，这主要由于是液料比增大，提取液在后续处理时造成多糖的损失。

图9 时间与液料比交互作用对HPS含量的交互影响图Fig.9 Effects of time and ratio of water to raw material on the content of HPS

图10为微波功率与温度交互作用对总糖含量的响应面和等高线图，由图10可知，微波功率对多糖含量的影响不显著，不随提取温度的升高而增加;提取温度对多糖含量的影响呈先增后减的趋势。这个结果是由于过低的温度不利于多糖的提取，升高温度，多糖的含量也会增大，而温度过高会导致多糖的水解，从而降低了多糖含量;而选取的微波功率范围对多糖的提取较为合适，因此，多糖的含量随微波功率的变化不大。

图10 功率与温度交互作用对总糖含量的响应面和等高线Fig.10 Effects of microwave power and temperature on the content of HPS

图11是时间与液料比交互作用对总糖含量的响应面和等高线图。从图11中可以看出，在提取时间和提取温度分别为30 min和50℃条件下，液料比对多糖含量有显著影响，而微波功率对多糖含量的影响不大。当液料比在10∶1～16∶1时，随液料比的增加多糖含量增加趋势明显，当液料比在16∶1～17.5∶1时，多糖含量变化比较平缓。

图11 时间与液料比交互作用对多糖含量的响应面和等高线图Fig.11 Effects of time and ratio of water to raw material on the content of HPS

图12是温度与液料比交互作用对总糖含量的响应面和等高线。由图12可以看出，随液料比的增大至而增大，直至达到一个平衡;而温度对多糖含量的影响呈先增后减的趋势。这一现象是多糖在溶剂中的溶解度有限，增加溶剂的量会由更多的多糖溶解在溶剂中，所以多糖的含量呈上升高趋势，而原材料中的多糖总量有限，当材料一定时，能够释放进入溶剂中多糖也一定，因此，随着液料比的进一步增大，多糖含量趋于平衡。

图12 温度与液料比交互作用对多糖含量的响应面和等高线Fig.12 Effects of temperature and ratio of water to raw material on the content of HPS

通过软件分析，得到响应面法优化微波辅助提取红芪多糖的最佳条件为微波作用时间44.55 min，微波功率212.68 W，温度79.77℃，液料比26.36∶1，提取次数为1次，在此条件下，HPS的含量可达10.56%。为检验RSA法预测结果的可靠性，采用上述最优提取条件进行多糖的微波辅助提取试验，同时考虑到实际操作的情况，将多糖最佳提取条件修正为提取时间45 min，微波作用功率213 W，温度80℃，液料比26∶1，提取次数为1次，3次平行试验实际测得的红芪多糖得率为(10.11±0.52)%，因此，采用RSA法优化得到的提取条件参数准确可靠，具有实用价值。

3.3 HPS的红外表征

图13 微波辅助提取的红芪多糖的红外光谱Fig.13 FT-IR spectroscopy of HPS.

图13为微波辅助提取的红芪多糖的红外光谱图。从图13可以看出，微波辅助提取的红芪多糖在3 418 cm-1有较强吸收峰，为伸缩振动;2 935 cm-1是由伸缩振动引起的;1 618 cm-1附近的吸收峰是由非对称伸缩振动引起的;在1 083 cm-1出现的强吸收峰是由糖环中的伸缩振动引起的。

3.4 HPS的分子质量

HPS分子质量的GPC色谱图如图14所示。由图14可以看出，HPS的色谱图的峰比较单一，表明HPS的组分没有聚集。GPC测定的HPS重均分子量为6.29×105，多分散性分别为3.42。

图14 红芪多糖的GPC图谱Fig.14 GPC chromatograms of samples Laser light scattering photometry for HPS

3.5 HPS的体外抗氧化活性

3.5.1 对羟自由基(·OH)的清除作用

微波辅助提取的HPS清除羟自由基(·OH)作用如图15所示。

图15 HPS清除·OH的抗氧化能力Fig.15 Effect of HPS on scavenging activity of·OH radicals

由图15可知，当HPS的浓度在0.02～1.0 mg/mL时，HPS对羟自由基的清除能力呈剂量依赖关系，随浓度的增大而增强;当浓度超过1 mg/mL时，红芪多糖对羟自由基的清除能力随浓度的增大趋势逐渐减缓，达到平衡。HPS的半数清除浓度(EC50)分别为0.55 mg/mL。羟自由基是体内产生的一种时间短、活性高的自由基，对有机体来说，危害非常大，被认为是与活细胞中所有功能性生物大分子反应最有效的氧化剂［12-13］。

3.5.2 对超氧阴离子(·O2-)的清除作用

图16 HPS清除·O2的抗氧化能力影响Fig.16 Effect of HPS on scavenging activity of·O2radicals

微波辅助提取的HPS清除超氧自由基(·O2)的影响如图16。由图16可知，不同提取得到的HPS与标准品VC对超氧自由基的清除能力都随HPS浓度的增大而升高，但在1 mg/mL时达到阈浓度，超过此浓度时，HPS清除超氧自由基的能力不再随浓度的升高而增大，其最大清除率达到65.37%。HPS的EC50为0.08 mg/mL。超氧自由基是大多糖生物反应与光化学反应所产生的高毒性自由基，可直接损伤重要的生物大分子，并可分解产生单态氧自由基与羟自由基［14］。而HPS可作为电子供给体，为产生的自由基提供了电子，从而终止了自由基的链式反应，进而减少了自由基的生成。

3.5.3 对DPPH自由基的清除作用

微波辅助提取的HPS清除DPPH自由基的影响如图17所示。

图17 HPS清除·DPPH的抗氧化能力Fig.17 Effect of HPS on scavenging activity of·DPPH radicals

由图17可知，0.02～2 mg/mL内，HPS对DPPH自由基的清除率随浓度的升高而增大，并呈剂量依赖;当HPS的浓度高于2 mg/mL时，这种趋势不再明显。HPS对DPPH自由基的EC50为0.52 mg/mL。从图17可以看出，HPS浓度较高时对DPPH自由基的清除率没有显著增强，这主要是由于多糖的溶解度的限制以及氢键的增加所造成的。

3.5.4 还原力

微波辅助提取的HPS还原力的影响如图18所示。由图18可知，在实验浓度范围内，HPS的还原力随浓度的增加而增强。在浓度为0.4 mg/mL之前，HPS的还原力增强趋势不明显，在0.4 mg/mL之后，随着HPS浓度的增大还原力明显增强，由此可知，HPS的还原力很大程度上依赖于浓度，浓度增大其活性基团的浓度也随之增加，相应地还原力随之增强。

图18 HPS的还原能力Fig.18 Effect of HPS on reducing power

4 结论

(1)本文利用响应面优化微波辅助提取HPS的工艺，其最佳提取参数:提取时间45 min，微波作用功率213 W，温度80℃，液料比26∶1，提取次数为1次，HPS的含量可达(10.11±0.52)%。本研究与胡燕等利用超声波法提取的研究结果相比，虽然时间比该法延长了10 min，但红芪多糖的含量由原来的7.8%左右升高到10%左右。

(2)红外光谱分析表明，微波辅助提取的HPS在3 418、2 935、1 618、1 083 cm-1都有吸收峰，此为多糖特征吸收峰，表明HPS为多糖;GPC测定结果显示，HPS重均分子质量为6.29×105。

(3)体外抗氧化活性测定实验表明，HPS能够清除羟自由基、超氧自由基、DPPH自由基，多糖能为自由基提供电子，终止自由基的链式反应。多糖清除羟自由基、DPPH自由基、超氧自由基以及其还原力会影响到红芪多糖的调节血糖、抗肿瘤等方面的生物学活性。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010.

［2］ 李晓东，封德梅，赵良功，等.红芪多糖HPS-3对2型糖尿病大鼠糖脂代谢和胰腺组织病理改变的影响［J］.中药药理与临床，2012，28(1):83-86.

［3］ 金智生，汝亚琴，李应东，等.红芪多糖对不同病程糖尿病大鼠血脂的影响［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2004，2(5):278-280.

［4］ 杨涛，郭龙，李灿，杨英来，封士兰.红芪多糖HPS1-D的化学结构和抗补体活性研究［J］.中国中医杂志，2014，39(1):90-92.

［5］ 魏舒畅，陈方圆，闫治攀，等.二次通用旋转组合设计优化红芪总多糖与皂苷的酶解提取工艺［J］.中成药，2014，36(2):286-290.

［6］ 王宗元.单因素试验法优选红芪多糖提取工艺的研究［J］.甘肃畜牧兽医，2010，2(211):9-11.

［7］ 胡燕，程卫东，刘欣，等.红芪多糖超声法提取工艺的正交实验优选研究［J］.时珍国医国药，2011，22(8):1 953-1 954.

［8］ 刘宝剑，郭彦，刁鹏飞，等.微波-超声波提取与常规法提取红芪多糖的比较研究.安徽农业科学.2007，35(30):9 703，9 722.

［9］ 张萍，梁新丽，廖正根，等.正交设计优选黄芪多糖的微波辅助与传统提取工艺研究［J］.江西中医学院学报，2009(9):33-35.

［10］ 张泽庆，田应娟，张静.防风多糖的抗氧化活性研究［J］.中药材，2008，2(31):268-272.

［11］ ZHAO B T，ZHANG J，GUO X，et al.Microwave-assisted extraction，chemical characterization of polysaccharides from Lilium davidii var.unicolor Salisb and its antioxidant activities Ebaluation［J］.Food Hydrocolloids，2013，31:346-356.

［12］ XIE J H，SHEN M Y，XIE M Y，et al.Ultrasonic-assisted extraction，antimicrobial and antioxidant activities of Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinskaja polysaccharides［J］，Carbohydrate Polymers，2012，89:177-184.

［13］ 张翠兰.人体自由基的产生与危害［J］.健康，1994，(8):183.

［14］ 周凤鑫.组织血液灌注与微循环的病理-氧化应激与疾病［J］.2007，6(l2):5-12.

［15］ 曹泽虹，董玉玮，王卫东，等.牛蒡菊糖的提取及其抗氧化性能的研究［J］.农业机械，2011，35:423-428.