副溶血弧菌DPO-PCR检测方法的建立*

李丹丹，徐义刚，王昱，邱索平，高会江，高慎阳

1(海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心，海南海口，570311)

2(黑龙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心，黑龙江哈尔滨，150001)

3(重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心，重庆，404100)

4(从化出入境检验检疫局，广东广州，510900)5(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，牛遗传育种研究室，北京，10019)6(辽宁医学院畜牧兽医学院，辽宁锦州，121001)

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)是一种革兰氏阴性嗜盐菌，在海水养殖的牡蛎、虾和蟹等贝类、甲壳类水生动物中分布广泛，是流行程度、危害程度最高的食源性致病菌之一［1］，人类进食被VP污染的食品会引起急性胃肠炎，严重者还可引起败血症［2-3］，是国际公认的食物中毒病原菌，其引发的食源性疾病已成为当前全球面临的公共卫生问题之一［4］。近年来，我国沿海地区常发生由该致病菌感染引发的食源性中毒事件，该菌也是我国进出口水产品检测的主要检测项目之一［5-6］。目前，对VP的检测以传统的细菌分离培养、生化鉴定为主。传统的细菌鉴定方法特异性差、灵敏度低并且耗时长、操作繁琐、受环境及主观因素影响大。

双启动寡核苷酸引物(dual-priming oligonucleotide，DPO)设计简单，不需要对退火温度进行优化及对引物进行筛选，简化了常规PCR方法引物设计的步骤［7-10］;另外，由于DPO引物结构特殊，该引物要比常规PCR引物的特异性更强，碱基错配发生3个或以上，扩增就会停止［11-12］，所以检测结果要比常规PCR方法更为精确。本研究利用该技术，建立了VP DPO-PCR快速检测方法，为有效检测VP提供技术支撑。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及临床样品

空肠弯曲菌、肠出血性大肠埃希菌O157:H7、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、变形杆菌、阪崎肠杆菌、粘质沙雷菌、创伤弧菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌、产肠毒素大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、肠侵袭性大肠杆菌、霍乱弧菌和副溶血弧菌等标准菌株购自美国典型菌种保藏中心;副溶血弧菌分离株由本中心实验室分离保存。550份水产品来自于水产品养殖场和水产品流通市场，包括虾、蟹、海水、蛏子、鲍鱼、海鱼、蛤蜊、泥螺、花蛤、海虹、海瓜子和象拔蚌等水产品。

1.1.2 主要试剂

细菌培养基和增菌培养基BPW，购自广东环凯微生物科技有限公司;细菌基因组DNA抽提试剂盒，购自北京康为世纪生物科技有限公司;Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl2，购自宝生物工程大连有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 引物设计

根据GenBank公布的VPtoxR基因序列(AB029915.1)中的保守序列，设计常规引物和DPO引物各一对，扩增片段大小均为349bp，两对引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

常规引物基因序列:

VP-CGF 5＇-ATCGTAGAGCCGTCTTTAGCGACGACTTCTGACGCA-3＇

VP-CGR 5＇-GGTTATTTTGTCCGCCAGTGGCAATTACTTCCACTG-3＇

DPO引物基因序列:

VP-DPOF 5＇-ATCGTAGAGCCGTCTTTAGCGACIIIIICTGACGCA-3＇

VP-DPOR 5＇-GGTTATTTTGTCCGCCAGTGGCIIIIICTTCCACTG-3＇

1.2.2 DNA模板的制备

1.1.1节中的菌株分别接种到5 mL增菌培养基BPW中，培养12 h后，取1 mL菌液按照试剂盒说明书提取细菌基因组DNA，-20℃保存备用。临床样品的检测采用煮沸法提取细菌DNA。

1.2.3 DPO-PCR反应条件的优化及电泳分析

对DPO-PCR反应体系中的各项反应参数和循环参数进行优化，筛选出DPO-PCR反应中最佳反应模式。

1.2.4 DPO-PCR退火温度不敏感性检测

将退火温度范围设为49～69℃，进行DPO-PCR和常规PCR扩增实验，产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.5 DPO-PCR特异性检测

利用建立的VP DPO-PCR检测方法对1.1.1节中的菌株进行扩增，产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，验证方法的特异性。

1.2.6 DPO-PCR灵敏性检测

提取VP基因组DNA并测定浓度，10倍倍比稀释DNA，原液至10-1～10-6，根据试剂盒提取每级稀释度细菌 DNA，各取2 μL作为模板进行 DPO-PCR扩增。

1.2.7 DPO-PCR检测方法的初步应用

将采集来的550份水产品(40份虾、20份蟹、65份海水、70份蛏子、15份鲍鱼、15份海鱼、75份蛤蜊、30份泥螺、50份花蛤、85份海虹、75份海瓜子、10份象拔蚌)经过处理匀浆后，均用营养肉汤增菌培养6 h，增菌液煮沸法提取DNA并进行DPO-PCR扩增，所得检测结果用行业标准法(SN/T 1870-2007)进行复检，以验证所建立的VP DPO-PCR检测方法的可靠性。

2 结果

2.1 VP DPO-PCR检测方法的确定

通过对DPO-PCR反应体系中各项反应参数和循环参数的优化，最终确定了VP最佳DPO-PCR反应模式。在20 μL反应体系中含有:10×PCR缓冲液2 μL，MgCl2(25 mmol/L)1.6 μL，dNTP 混合物(2.5 mmol/L)2.0 μL，引物各 0.2 μL，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，DNA 模板 2 μL，去离子水补充至 20 μL。反应程序:95℃ 3 min;94℃ 1min，58℃ 50 s，72℃50 s，25个循环;72℃ 10 min。对琼脂糖凝胶电泳分析获得了约349 bp的目的片段(图1)。通过基因测序，结果显示已成功扩增出目的基因。

图1 VP toxR基因DPO-PCR扩增结果Fig.1 DPO-PCR products of VP toxR gene

2.2 DPO-PCR退火温度不敏感性

退火温度设定在49～69℃，由图2-B可以看出，DPO-PCR均能有效扩增出VP toxR基因，说明DPO-PCR退火温度范围较宽并且对退火温度不敏感，而常规PCR扩增效果较差，存在最佳的退火温度(图2-A)。

图2 退火温度对PCR扩增的影响Fig.2 Effect of annealing temperature on PCR amplification

2.3 DPO-PCR方法特异性扩增结果

利用建立的DPO-PCR检测方法对1.1.1节中的菌株进行扩增，结果显示:以toxR基因为靶基因进行扩增，只有VP及其分离株扩增出349bp特异性条带，其它菌株均未出现任何扩增条带(图3)，表明所建立的VP DPO-PCR检测方法特异性强。

图3 VP DPO-PCR特异性实验检测结果Fig.3 Specificity of DPO-PCR detection of VP

2.4 DPO-PCR方法检测灵敏度

10倍系列稀释菌液按试剂盒提取每级稀释度细菌DNA，按2.1优化出的DPO-PCR反应条件进行检测，结果表明在20 μL反应体系中，模板DNA加入2 μL，菌体浓度自1.21×107CFU/mL至1.21×102CFU/mL均可扩增出清晰条带，菌体浓度为1.21×101未扩增出条带(图4)，表明本实验建立的 DPOPCR方法检测VP灵敏度为1.21×102CFU/mL。

图4 VP菌液稀释法DPO-PCR敏感度检测结果Fig.4 Sensitivity of DPO-PCR for detection of VP dilution

2.5 DPO-PCR检测临床样品的实验结果

利用建立的VP DPO-PCR检测方法对550份样本进行了检测，检出19份VP阳性样本，所得检测结果经行业标准法(SN/T 1870-2007)进行复检，2种方法检测结果的一致率为100%(见表1)，显示该方法具有很好的可靠性。

表1 应用DPO-PCR检测结果Table 1 Applications DPO-PCR test results

3 讨论

目前，包括我国在内的绝大多数国家针对食源性致病菌的检测仍主要依靠传统细菌分离鉴定的方法，即首先利用选择性培养基增菌，进而结合生化及血清学方法进行鉴定。传统检测方法存在检测效率低、灵敏度低且耗时长、操作繁琐等不足。通常情况下，鉴定一种细菌需要5～7 d，而针对一些生化特性复杂的细菌，如单增李斯特氏菌的检测周期可长达20 d之久，严重影响了检测鉴定的周期，很难适应现代化食品安全快速检测的需要［13］。PCR技术具有快速、特异性强和灵敏度高等特点，是目前食源性致病菌检测主要采用的检测技术之一。在此基础之上，又相继发展了DNA探针技术、实时荧光PCR技术以及PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术等，虽然能够满足快速检测的需求，但是对引物设计的要求很高，不仅需要对引物进行筛选，而且需要优化退火温度，增加了实验操作步骤，费时又费力。在本研究中，引入了新型的DPO引物设计方法，建立了VP DPO-PCR检测方法。

在本研究DPO-PCR退火温度不敏感性实验中，实验结果显示，退火温度设定在49～69℃，DPO-PCR均能有效扩增出目标基因，说明DPO-PCR退火温度范围较宽并且对退火温度不敏感，而常规PCR扩增结果则受退火温度变化的影响较大，扩增效果相对较差;在DPO-PCR特异性实验中显示，建立的 DPOPCR能够准确地扩增出目标菌，其他菌株均未出现任何扩增条带，表明所建立的VP DPO-PCR检测方法特异性强。临床样品检测结果表明，利用建立的VP DPO-PCR检测方法能够对实际样品中的VP进行准确检测，与行标法(SN/T 1870—2007)的检测结果一致，具有良好的实用性。

本研究建立的DPO-PCR检测方法，DPO引物设计简单，简化了常规PCR引物设计步骤，提高了检测效率;并且由于DPO引物结构特殊具有比常规PCR引物更强的特异性，其检测结果要比常规PCR的检测结果更为准确，DPO-PCR检测方法的建立为VP快速精准的检测提供了新方法、新手段。

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