超高压杀菌处理和热处理对香港牡蛎肉品质的影响

王晓谦，秦小明，郑惠娜，章超桦

(广东海洋大学食品科技学院，广东省水产品加工与安全重点实验室，广东普通高等学校水产品深加工重点实验室，国家贝类加工技术研发分中心(湛江)，广东湛江，524088)

超高压加工技术是近年来新兴起的非热加工技术。它是指将食品经包装后放入密封的、施加高强度压力的容器中，常用水或矿物油等流体作为传递压力的介质，在静高压(大于100 MPa)一定温度下处理一段时间，导致食品成分、非共价键(氢键、离子键和疏水键等)的破坏或形成，使食品中的蛋白质、酶、淀粉等生物大分子物质变性、失活和糊化，同时杀死食品中的微生物，进而达到食品灭菌、加工和保藏的目的。与传统的热处理相比，对食品的色香味、功能性及营养成分有较好的保护作用。

牡蛎营养价值丰富，味道鲜美。但牡蛎开壳后，由于没有组织的保护，很容易产生破肚、黄变等伤害，自身的有机体也会发生复杂的生理生化反应而直接影响牡蛎的质量。加之牡蛎肉质柔软，不耐藏，不耐冻，给新鲜牡蛎的流通造成了一定的难度，进而限制了牡蛎产业化发展。

本研究以优化的杀菌工艺作为超高压处理条件，比较分析超高压处理和热处理对牡蛎营养成分、肌肉品质以及呈味成分含量的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)，选取长度为12～14 cm鲜活牡蛎，购于湛江市霞山东风水产批发市场;海水，取自湛江东海岛海水井;真空包装袋(PE+PET双层复合，双面0.14 mm)，河北新兴塑料厂;戊二醛(AR)，国药集团化学试剂有限公司;三磷酸腺苷(ATP)、鸟苷酸(GMP)、肌苷酸(IMP)、二磷酸腺苷(ADP)、次黄嘌呤核苷酸(Hx)、磷酸腺苷(AMP)、次黄嘌呤(HxR)、乳酸、琥珀酸甜菜碱(GR)，Sigma公司。

超高压设备HPP.L2-600/0.6，天津华泰森淼生物工程技术有限公司;质构分析仪TMS-PRO，美国FTC公司;色差计CR-10，日本美达能;水浴锅HHS，上海博迅实业有限公司医疗设备厂;差示扫描量热仪DSC204F1，德国NETZSCH公司;气相色谱质谱联用仪SHIMADZUQP-2010Plus，日本岛津公司;高效液相色谱仪LC-20AD，日本岛津仪器有限公司;数显pH计PHS-25，上海康仪仪器有限公司;精密电子天平BL-6205，上海市岛津制作所;自动凯氏定氮仪KDN-08C，上海新嘉仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 牡蛎肉的前处理

牡蛎经净化［1］后，分成3组，即空白组(control)，超高压组(high pressure，HP)和加热组(high temperature，HT)。空白组未经任何处理;超高压处理条件为压力300 MPa，保压时间20 min，处理温度为30℃(升压速度为30 MPa/s，卸压速度200 MPa/s);热处理组条件［2］为75℃水煮加热8 min。

1.2.2 基本营养成分测定

水分含量的测定:105℃恒温烘箱干燥法，参考GB/T 5009.3-2010。

粗蛋白含量的测定:凯氏定氮法，参考 GB/T 5009.5-2010。

粗脂肪含量的测定:索氏抽提法，参考 GB/T 5009.5-2003。

总糖含量的测定:分光光度法，参考 GB/T 9695.31-2008。

灰分的测定:高温灼烧法，参考 GB/T 5009.4-2010。

1.2.3 pH值测定

牡蛎的pH的测定方法参照《水产品卫生标准的分析方法》(GB/T 5009.45-2003)。将牡蛎肉绞碎均匀，取10 g肉糜，加入90 mL蒸馏水，搅拌均匀，静置30 min，用pH计测定其pH值。每组测定3次，取平均值。

1.2.4 质构的测定

将经过超高压处理的牡蛎肉的闭壳肌取下，根据要求剪成高4 mm、直径6 mm的圆柱状，牡蛎组织(简称组织组)的测定则选取背部肌肉腮丝方向5 mm处为佳，每个处理条件4个平行样。

测定前将样品放置室温，选择直径50 mm平底柱形探头P/50，测定条件为:距离6 mm，形变百分量为50%，检测速度为60 mm/min，起始力0.5 N。测定及计算参数包括硬度、弹性、内聚性和咀嚼度。各参数的检测和计算参照Bourne［3］质构特性参数的计算方法。

1.2.5 色差的测定［4］

利用色差计反射法来测定牡蛎表面的颜色，分别测定香港牡蛎背部、腹部和背部肌肉的颜色，用L、a、b值来描述牡蛎颜色的变化。L值表示样品亮度，+a代表偏红，-a代表偏绿，+b代表偏黄，-b代表偏蓝。由于水产品个体差异性较大，因此每组4只牡蛎，每只牡蛎的不同部位测定10次，取平均值作为样品色值来源。

1.2.6 差示扫描量热(DSC)分析

参照赵伟［5］的方法。取剁碎闭壳肌、匀浆牡蛎肉样品6 mg左右，置于DSC铝盒中，然后用配套铝盖密封，记下样品的精确质量，以空白铝盒作为对照，以10℃/min的加热速度使铝盒温度从30℃上升到130℃。记录并计算吸热曲线上蛋白质变性的起始温度(T0)，峰值温度(Tp)，终止温度(Tc)。

1.2.7 光学显微镜

参考黄万有［6］的方法，略有改动。将牡蛎闭壳肌和背部肌肉腮丝方向5 mm处附近组织样品切下，用10%甲醛固定，用体积分数30%、50%、70%、90%、100%乙醇脱水，然后浸泡于50～60℃石蜡中，再进行包埋，使用切片机将已包埋好的蜡块贴在洁净的载玻片上，用乙醇进行复水(体积分数依次为90%、70%、50%、30%)，采用苏木精-伊红(HE)染色法进行染色，烘干，然后至于光学显微镜下进行观察拍照。

1.2.8 扫描电镜

参考Nishimura［7］的方法，略有改动。将经不同处理后的牡蛎的闭壳肌和组织切成较小的薄片至于4℃下，用体积分数2.5%戊二醛固定3 d，用0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗数次，每次15 min，于室温下用30%、50%、70%、90%乙醇梯度脱水，各15 min，再用100%乙醇脱水2次，每次1 h。样品脱水后，进行冷冻干燥，随后用离子溅射仪给干燥好的样品表面镀一层金属膜，扫描电子显微镜(SEM)在电压为15.0 kV下放大相应倍数500×，进行扫描电镜观察。

1.2.9 呈味成分

1.2.9.1 游离氨基酸的测定

柱前衍生法测定［8］。

1.2.9.2 核苷酸及其关联化合物的测定

参照刘亚［9］的方法，略有改动。

洗脱条件:二元梯度洗脱，梯度洗脱程序为0～14 min为流动相A洗脱，14～18 min时流动相B由0增至25%，18～22 min时流动相B上升至90%，22 min过渡到用100%流动相B进行洗脱，保持B洗脱15 min。

标准溶液的配制:分别准确称取ATP、GMP、IMP、ADP、Hx、AMP、HxR 标准品0.012 5 g，用超纯水溶解并混合定容于25 mL容量瓶中，成为混合标准。再进行稀释，分别配制成 2、10、20、50、100、500 μg/mL 的混合标液，上机前再用0.22 μm的微孔滤膜过滤。

1.2.9.3 有机酸的测定

有机酸的测定参考GB/T 5009.157-2003及刘亚［10］等的方法。

样品处理:准确称取5g左右牡蛎匀浆，用30 mL 2%NH4H2PO4(pH 2.5)混匀，超生振荡20 min，12 000 r/min离心20 min，取上清液，沉淀重新用10 mL 2%NH4H2PO4提取2次，定容至50 mL，4℃保存备用。

HPLC条件:色谱柱:Cosmosil 5 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);检测波长:205 nm;柱温:25 ℃;进样量20 μL;流动相:2%NH4H2PO4(pH 2.5)，流速1.0 mL/min。

1.2.9.4 无机离子的测定

阳离子(K+、Na+):采用试剂盒测定。

阴离子:Cl-采用硝酸银滴定法(GB/T 12457-2008)，P043-用铝蓝比色法(GB/T 5009.87-2003)。

1.2.9.5 甜菜碱的测定

采用雷氏盐结晶比色法，参考陈德慰［11］及NY/T 1746-2009。

1.2.10 数据处理

每个试验重复3次，数据用“平均值±标准差”表示;方差分析(ANOVA)用JMP 7.0软件进行显著性(P＜0.05)分析，作图采用origin8.5软件。

2 结果与分析

2.1 UHP和热处理对基本营养成分的影响

牡蛎不同处理方式的基本营养成分见表1。从表1中可以看出，香港牡蛎经超高压处理后，水分含量显著增多(P＜0.05)，这可能是因为高压促进了水分的溶出［12］，另外高压促进了蛋白质发生水合作用，进而导致蛋白质吸收了水分［13］;蛋白质含量显著降低(P＜0.05)，说明超高压处理会使蛋白质发生变性，导致含量降低，也可能是因为超高压处理后使牡蛎黏液的粘性增强，使得盐溶性蛋白质和灰分吸出［14］;粗脂肪含量和总糖含量均未发生显著变化(P＞0.05);灰分含量显著减少(P＜0.05)。综合比较，可以认为超高压处理能够较好的保留香港牡蛎的原有营养成分。

表1 不同处理方式对香港牡蛎基本营养成分的影响 %Table 1 Proximate compositions of oysters by different treatment

2.2 UHP和热处理对pH的影响

图1所示的是牡蛎经不同处理方式处理后对pH值的影响。

图1 不同处理方式对pH的影响Fig.1 The influence of different treatment on pH

从图1中可知，超高压处理比未经处理的牡蛎有较大的pH值，压力增大pH值显著增大(P＜0.05)。Cruz-Romero［2］的研究也出现了类似的情况，这可能是因为压力造成某些蛋白质变性引起的，使得影响pH值的低分子化合物的氨基增多，导致pH值增大［15］。另一方面，超高压处理后，由于牡蛎表面残留的生理盐水被吸收，而生理盐水的pH值比牡蛎的pH值高。加热处理的牡蛎pH值最大，可能是由于加热造成蛋白质中酸性基团减少2/3左右，而碱性基团的数量几乎没有变化［16］。与热处理相比，超高压组pH值更接近空白组。

2.3 UHP和热处理对质构的影响

图2是不同处理方式对牡蛎闭壳肌和组织硬度、弹性、咀嚼性和内聚性的影响。

图2 不同处理方式与硬度、弹性、咀嚼性、内聚性的关系Fig.2 The influence of different treatment on hardness，springiness，chewiness，cohesiveness

超高压处理后闭壳肌硬度显著增大，这与Ashie［17］的研究结果相似。发生这种变化的原因是压力升高，牡蛎体积被压缩，进而促进了蛋白质之间的相互作用。影响硬度的因素还有很多，如含水量、蛋白质含量等。咀嚼性随压力的变化与硬度呈正相关，这种变化是因为高压引起蛋白质变性形成凝胶导致的。超高压对弹度的影响不显著(P＞0.05)，影响弹性的主要因素有含水量、pH值等。

超高压处理后牡蛎组织的硬度、弹性、咀嚼性随压力变化显著降低(P＜0.05)，内聚性变化不显著(P＞0.05)。这是由于牡蛎组织的含水量比闭壳肌要大得多，超高压作用后使水分吸出，导致硬度、弹性、咀嚼性都降低。但热处理组质构各指标的变化比超高压组更为突出，因为热处理导致蛋白质发生严重不可逆变性。

2.4 超高压处理对色差的影响

图3为不同方式处理对牡蛎L值、a值、b值的影响。

图3 不同处理方式对L值、a值、b值的影响Fig.3 The influence of different treatment on L，a，b

比较了牡蛎背部、腹部和背部肌肉的变化，其中背部肌肉的变化最为明显。超高压处理后，L值显著增大，a值、b值显著降低。超高压处理后肌肉颜色的变化最为明显，这是因为肌纤维蛋白质和肌浆蛋白质的变性导致的。这个结果与Cruz-Romero［2］的结果相似。用肉眼观察(图4)，HP组与空白组的牡蛎相比，外观有点微黄，而热处理后的牡蛎整体发白。脂肪氧化是颜色改变的一个原因，超高压处理后脂肪氧化加快的主要原因是游离金属离子含量增多。牡蛎闭壳肌和组织颜色的改变可能与蛋白质变性和脂质氧化有关［18］。整体来看，由于蛋白质受热凝固，热处理组牡蛎腮丝等部位发生明显扭曲变形，因此，与热处理相比，超高压在牡蛎外观更接近空白组。

图4 不同处理方式对牡蛎色泽的影响Fig.4 The influence of different treatment on colour

2.5 UHP和热处理对DSC的影响

图5为不同处理方式对牡蛎闭壳肌和组织DSC的结果。空白组牡蛎闭壳肌的DSC图谱中肌球蛋白和肌动蛋白的2个峰未能完全分开，但超高压组2个吸收峰趋于平缓，表明超高压处理后牡蛎中蛋白质发生了明显的变性。主要原因是蛋白质在超高压作用下，其静电力和疏水相互作用都会受到影响，就会形成少量的氢键继续维持原有蛋白结构，但是热处理组则会引起肌球蛋白和肌动蛋白产生不可逆的变性，导致图中2种蛋白的峰趋于平缓［19］。牡蛎组织 DSC的结果与闭壳肌的变化相似。

2.6 UHP和热处理对牡蛎肉的光学显微镜和扫描电镜结果比较

超高压处理牡蛎后，对牡蛎闭壳肌和组织的光学显微镜观察结果如图6所示。

从图6和图7中可以看出，空白组的牡蛎肌肉结构比较疏松，经超高压处理后，结构较为紧密，热处理组结构最为紧密。原因有以下几点:超高压导致水分吸出，使肌肉内水分减少，导致结构紧密，随着压力进一步提高，肌纤维受压力的作用逐渐增大，使得肌纤维之间的空隙明显因为受到压力作用而变小，同时DSC分析结果表明肌动蛋白和肌球蛋白发生变性，蛋白质分子间的非共价键断裂，而蛋白质分子间新形成的化学键导致肌肉纤维发生聚集［20］，另外，蛋白质变性使得其内部的自由水溶出，使得肌肉组织更为紧密。

2.7 UHP和热处理对呈味成分的影响

游离氨基酸不仅是水产品鲜味的主要来源，同时还体现出甜味、苦味等多种复杂的滋味特征，更重要的是他还可以与核苷酸等物质一起，起到显著提升海产品总体滋味品质的效果，同时对调节贝类体内的渗透压有重要作用。甜菜碱可以提升体系的甜味、鲜味、海产风味和总体风味。牡蛎的主要能源贮存形式是糖原，糖酵解会产生琥珀酸，影响食品的风味。此外，水产品中不可或缺的辅助呈味成分还有无机离子。不同处理方式牡蛎的呈味成分含量见表2。

图5 牡蛎闭壳肌、组织不同处理方式的DSC图谱注:A组为闭壳肌组，B组为组织组，1、2、3分别为空白组、HP组、HT组Fig.5 DSC thermograms of oyster muscle and tissue subjected to different treatments

图6 牡蛎闭壳肌、组织不同处理方式的显微结构注:放大倍数为10倍目镜;A组为闭壳肌组，B组为组织组，1、2、3、分别为空白组、HP组、HT组Fig.6 Microscopic structure of oyster muscle and tissue by different treatments

图7 牡蛎闭壳肌、组织不同处理方式的扫描电镜图注:放大倍数为500倍;A组为闭壳肌组，B组为组织组，1、2、3分别为空白组、HP组、HT组Fig.7 SEM views of oyster muscle and tissue by different treatments

表2 牡蛎呈味组分、含量及呈味强度值Table 2 The concentrations，taste thresholds and TAVs of taste-active components in oyster

香港牡蛎的游离氨基酸主要有丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸、精氨酸和天冬氨酸。鲜味氨基酸主要是谷氨酸，其刺激阈值较低，使牡蛎有鲜美醇厚的味道。超高压处理后，游离氨基酸含量有所增加，这表明，牡蛎在经超高压处理的过程中，发生了一定的生理生化反应，使得蛋白质的水解程度增强，导致游离氨基酸的含量有所增加。这与赵伟［5］的研究结果一致。热处理会造成游离氨基酸大量的流失，可能是处理过程中存在大量的汁液流失。

ATP及其关联化合物是影响牡蛎风味的另一类重要的物质，尤为突出的是IMP，IMP可以在单独呈味的同时又与谷氨酸钠起到相辅的作用，使鲜味增强［21］。在甲壳类动物中，由于AMP脱氨酶有较低的活性，容易积累［21］，因此AMP的含量较高。空白组可以看出，AMP和IMP对牡蛎的滋味有重要贡献。高压处理和热处理后，ATP及其关联化合物含量除IMP外都显著增多。

乳酸和琥珀酸是与贝类呈味相关的主要有机酸［22］。其含量较为丰富的原因是因为牡蛎中含有较为丰富的糖元。与空白组相比，高压处理和热处理后，乳酸和琥珀酸的的含量显著下降(P＜0.05)，但热处理下降更为严重，分别由2.64、8.50下降到了2.39、5.79 mg/100 g，分别损失了9.47%和31.88%。

甜菜碱是一类季铵类化合物，是一种重要的甜味物质，超高压处理对其影响不显著。无机离子对水产品的滋味也起到增强作用，超高压处理和热处理都能使其含量显著降低，且热处理降低更为明显。

3种处理方式整体比较来看，超高压组比热处理组更为接近空白组。

3 结论

以新鲜牡蛎为对照，分析比较了超高压处理和热处理对香港牡蛎的营养成分、pH值、色差、肌肉组织品质、呈味成分、挥发性成分等的影响。与新鲜牡蛎相比，超高压对牡蛎品质有不同程度的改变，高压使牡蛎水分含量增加2.47%，蛋白质和灰分含量分别降低1.48%和0.76%，粗脂肪、总糖含量、水解氨基酸和脂肪酸组成未发生显著变化。与热处理相比，超高压处理更有利于保留牡蛎原有的营养成分。

与新鲜牡蛎相比，超高压处理能使蛋白质发生轻微变性，致使pH值增大0.14，蛋白酶水解活力和Ca2+-ATP酶活力分别下降了34.26%和7.81%;闭壳肌硬度和咀嚼性显著增大，组织的硬度、弹性和咀嚼性显著降低;高压使L值显著增大，a、b值显著降低，且肌肉颜色的变化最为严重;同时DSC、光学显微镜和扫描电镜结果也显示，超高压会使蛋白质发生变性，并使其结构变得更为紧密。热处理后的牡蛎蛋白质发生严重变性。

与新鲜牡蛎相比，超高压使游离氨基酸含量、ATP及其关联化合物(IMP除外)及有机酸显著增加，无机离子的含量显著降低，甜菜碱变化不显著。热处理的变化比超高压处理的变化更为明显。

超高压处理后的牡蛎品质虽发生不同程度改变，但与热处理相比，超高压处理的牡蛎更接近新鲜牡蛎，更能保持牡蛎原有的营养和色泽。

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