利用16S rRNA基因克隆文库分析东北自然发酵酸菜中细菌多样性

曹碧璇，胡滨，刘爱平

(四川农业大学食品学院，四川雅安，625014)

传统发酵蔬菜主要是利用乳酸菌等微生物进行发酵制作而成，目前是我国产量最高的蔬菜加工产品。东北酸菜以白菜为主要发酵原料，天然附着在白菜表面上的微生物利用白菜中的糖类等营养物质后产酸发酵，从而形成一种特色发酵蔬菜食品。酸菜发酵过程与细菌的生长代谢、汁液与白菜的生物化学作用有极其紧密的联系，在此过程中白菜细胞内部的化学成分会发生一系列变化［1-2］，从而形成酸菜独特的风味，其味道咸酸，口感脆嫩，可以增进食欲，帮助消化。

目前，我国对传统发酵食品中微生物群落组成研究仍然以纯培养技术为主，一般是利用纯种分离技术筛选某一类群微生物(如乳酸菌)［3-9］。但是，随着研究的不断深入和技术的进步，逐渐发现发酵液中微生物的种类实际数量远远多于用培养法获得的种类数，基于纯培养的方法不能准确反映复杂样品中微生物多样性的真实情况。近年来微生物分子生态学技术得到快速发展，利用这些技术可以避开微生物培养环节，通过提取环境微生物基因组直接从DNA水平研究环境微生物的多样性和群落结构［10-12］。例如，武俊瑞等(2014)采用16S rRNA基因PCR-DGGE技术开展了传统东北酸菜发酵液中的微生物多样性的研究［13］，揭示了传统酸菜发酵液中微生物的多样性，及优势菌群的系统发育关系。本研究在提取发酵液微生物DNA后，PCR扩增16S rRNA基因全长序列，通过建立该基因克隆文库的方法，进一步研究发酵液中细菌的种类组成，分析优势菌群结构，以期准确了解东北酸菜发酵液中的微生物资源和酸菜发酵机理，为今后改进发酵工艺和发展相应微生态制剂奠定一定的基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与药品

细菌基因组DNA提取试剂盒、快捷型DNA纯化回收试剂盒、2×Power Taq PCR MasterMix、DH5α 感受态细胞(Bioteke);Zero Background TA TOPO Cloning Kit(Clone Smarter);琼脂粉(Amresco);酵母提取物、胰蛋白胨(Oxoid);DL2000 DNA Marker、溴化乙锭、λDNA-Hind Ⅲ Marker(TaKaRa);Tris-base、EDTANa2、氨苄青霉素等为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Universal HoodII凝胶成像仪，Bio-RAD;台式离心机1-14，Sigma;SW-CJ-2FD净化工作台，苏州安泰空气技术有限公司;MLS-3780高压灭菌锅，SANYO;THZ-98AB恒温振荡培养箱，上海一恒科学仪器有限公司;μQuant酶标仪，BioTek;ST16R高速冷冻离心机，Thermo Scientific;DYY-10水平电泳仪，北京六一仪器厂;Mastercycler nexus gradient eco PCR扩增仪，Eppendorf;ExF32086V-ULTS超低温冰箱，Thermo Scientific。

1.3 实验方法

1.3.1 样品的采集及预处理

样品采集:样品釆自辽宁地区农家利用传统方法制作的自然发酵成熟的酸菜发酵液5份，发酵时间均不低于50 d。

菌体富集:酸菜发酵液样品用灭菌滤纸过滤以除去酸菜汁中的杂质。取30 mL滤液，4℃ 6 800 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀加入25 mL的PBS缓冲液，在漩涡混匀器上振荡2 min，6 800 r/min离心10 min，弃上清液，加少量ddH2O洗涤，将沉淀转移到1 mL的无菌离心管中，4℃，14 000 r/min离心10 min，弃上清液，菌体于-20℃保存。

1.3.2 样品细菌基因组DNA的快速提取

采用细菌基因组提取试剂盒提取(Bioteke)，具体操作参照说明书。

1.3.3 构建16S rRNA基因克隆文库

以提取的细菌基因组DNA作为模板，使用细菌通用引物27F(5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇)和 1492R(5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇)对细菌16S rRNA基因全长进行扩增［14］。PCR反应体系(50 μL):PCR MasterMix 25 μL，引物 27F和1492R 各1 μL，模板 DNA 1μL，加去离子水补齐 50 μL。热循环反应条件:(1)95℃预热5 min;(2)95℃变性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸 1 min，30 个循环;(3)72℃延伸10 min。PCR产物采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

PCR产物经纯化后，与Zero Background TA TOPO Cloning Kit试剂盒内pCloneEZ-TOPO载体连接，重组质粒转化到E.coli DH5α中，然后在含50 μg/mL的氨苄青霉素LB固体琼脂培养基上37℃培养12～16 h。挑取白色单菌落于2 mL含50 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中37℃摇床振荡培养12 h，吸取1 μL菌液作为模板，用载体通用引物对其进行PCR扩增，采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测正确的克隆子。

1.3.4 16S rRNA基因序列分析

将含有正确克隆子的菌液送中美泰和公司测序。手动删除所得序列中的载体序列，然后利用GenBank的BLAST-n程序进行相似性比对，寻找与之亲缘关系最近的可培养菌种的序列。利用DNAMAN软件进行多序列比对，相似性≥97%视为同一操作分类单元(operational taxonomicunit，OTU)［15］。使用 MEGA4.0软件中的程序并采用Neighbor-Joining法构建系统进化树，并使用Bootstrap(1 000次)对进化树进行验证。

2 结果

2.1 发酵液细菌总DNA的提取和16S rRNA基因的PCR扩增

采用细菌基因组提取试剂盒(Bioteke)提取出样品中的总DNA。选用通用引物27F和1492R对发酵液16S rRNA基因的全长序列进行PCR扩增，扩增产物后经过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。实验结果表明此引物对可以较完整地从样品微生物基因组DNA中扩增出清晰单一，无非特异性扩增的片段，长度约为1 500 bp，符合细菌16S rRNA基因片段大小。

图1 酸菜样品16S rRNA基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱Fig.1 Agarose gel electrophoresis of 16S rRNA gene PCR products from Suan-Cai sample

2.2 发酵液16S rRNA基因克隆文库分析

将克隆文库中菌液PCR鉴定结果为阳性的菌液测序，去除嵌合体后共98个克隆子为正确克隆子。测得的16S rRNA基因全长序在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)网站上的BLAST-n进行比对。将序列相似性≥97%的序列视作一个OTU，低于97% 的则列为另一个OTU，共划分为9个OTU(表1)。共有63个(64.29%)克隆子属于乳酸杆菌属(Lactobacillus)，占绝对优势，其中 OTU1为 Lac.coryniformis，61个克隆子;OTU5和 OTU6分别为Lac.malefermentans和Lac.plantarum，各一个克隆子(图2)。片球菌属(Pediococcus)共22个克隆子(OTU2)，占22.45%，鉴定为 P.parvulus。OTU3为枸橼酸杆菌属(Citrobacter)，共 8个克隆子，占8.16%，均为 Citr.murliniae。OTU4为梭菌属(Clostridium)为 2个克隆子，占 2.04%，鉴定为Clos.Intestinale。OTU7，8和9均包含一个克隆子，各占1.02%，分别鉴定为串珠菌属(Leuconostoc)的Leuc.citreum，无色杆菌属(Achromobacter)的A.spanius和肠杆菌属(Enterobacter)的E.cloacae。

表1 所得OTU及与其亲缘关系最近的已知菌种Table 1 OTUs from 16S rRNA gene library and their phylogenetic analysis

图2 酸菜发酵液中16S rRNA基因文库菌株分布Fig.2 Distribution of microbial genus based on 16S rRNA library of Suan-Cai

2.3 系统发育分析

选取本研究中所占比例较大的OTU1和OTU2的代表序列和其他OTU的所有序列及具有最高相似性的可培养菌种的序列构建系统进化树(图3)。所得序列分成两个门类，分别为Firmicute和Proteobacteria，其中大部分为Firmicute相关的序列(89.8%)。Firmicute类群含有Lactobacillaceae、Leuconostocaceae和Clostridiaceae的序列。其中，Lactobacillaceae的大部分序列属于 Lactobacillus，bootstrap支持率为100%，其次为Pediococcus。检测到的Lactobacillus序列分别与Lact.coryniformis subsp.torque、Lact.malefermentans和Lact.plantarum的序列聚类在一起，序列数所占比例最大(62.24%)的OTU1代表序列F2和F3与Lact.coryniformis subsp.torque序列聚为一支，而 OTU2的代表序列 F30(22.45%)与P.parvulus聚类在一起。序列F11、L25和Clostridium intestinale的序列聚类在一起，远离其他分支，它们与Lactobacillaceae和Leuconostocaceae的序列亲缘关系较远。另外，在 Firmicute类群中，一个序列与Leuc.citreum NR 074694密切相关，相似性达到100%。在Proteobacteria类群中，本研究所得序列分布在两个分支中，分别由Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria序列构成。Betaproteobacteria亚类中只含有一个与A.spanius密切相关的序列。9个序列与Gammaproteobacteria的Enterobacteriaceae菌株的序列聚类在一起，bootstrap支持率为100%。然而，除了序列R5和F21与Enterobacter ludwigii和Citro.murliniae聚为一支外，其余7个序列单独聚为两类。

3 讨论

本研究采用构建克隆文库的方法，对克隆子的16S rRNA基因全长序列进行测序，在此基础上鉴定酸菜自然发酵液微生物群落组成。从总体来看，东北酸菜自然发酵液中，乳酸菌占绝对优势，这与以往以大白菜为原料的东北酸菜的相关研究，以及其他蔬菜为原料腌制酸菜的研究结果相一致［7，11-13］。杨洪岩等以黑龙江省绥化地区自然发酵白菜为对象，开展了东北酸菜发酵过程中微生物组成动态的研究，在发酵液中检测到Acinetobacter、Pseudomonas、Klebsiella、Citrobacter、Leuconostoc、Lactobacillus 等几个属和 Betaproteobacteria;而且发酵30 d后，所检测到的细菌全部为 Lactobacillus［16］。武俊瑞等利用 PCR-DGGE 技术在东北酸菜发酵液中分离和鉴定出Lactobacillus属的9个种［13］。Miyamoto等在哈尔滨地区酸菜液中分离到乳酸菌的新种(Lact.harbinensisDSM 12745)［17］。本研究选用的发酵液是成熟发酵液(50 d以上)，在发酵液中除检测到乳酸菌属的3个种外，还检测到Pediococcus parvulus、Citrobacter murliniae、Clostridium intestinale、Leuconostoc citreum、Achromobacter spanius和 Enterobacter cloacae。

图3 基于16S rRNA基因序列构建的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree based on the complete 16S rRNA gene sequences

美国的学者们利用形态学和生理生化反应鉴定出以圆白菜为原料的酸菜初期发酵液中包含Leuc.mesenteroides、Lact.brevis、P.pentosaceus和 Lact.plantarum等，而在发酵后期则主要为Lact.Plantarum［18］。这些属在本研究中也均被检测到，只是所属的种不同。田伟等(2012)通过构建16S rRNA基因文库，研究了四川泡菜发酵液中细菌群落组成，发现所有的克隆子均属于乳酸菌，主要分布于Lactobacillus和Pediococcus两个属，且Lactobacillus属占有绝对的数量优势［19］。在本研究中，Lactobacillus和Pediococcus两个属的克隆子分别占64.29%和22.45%，也占绝对优势，与以往的研究基本一致，但本研究中的优势种为Lact.coryniformis、P.parvulus 和 C.murliniae，而 Lact.plantarum虽然也被检测到，但克隆子数量远远低于这几个种，这与以往的采用纯培养和PCR-DGGE技术的一些研究结果有些不同［11-13，20］。其主要原因可能是选用的研究方法和选取的实验材料不同所致。在酸菜生产过程，微生物多样性和群落组成结构一般会随着发酵的进程而发生变化［16，21］，一些真菌在其中也会起一定的作用［22］，在后续的研究中应该不断补充和完善，以便更全面地了解酸菜的发酵机理。

另外，本研究采用16S rRNA基因的全长序列构建克隆文库，序列较长(1.5 kb)，测序后进行序列比对鉴定物种时准确性较高，可以较真实地反映实验样品的微生物群落结构组成，而且还能提供很多传统纯培养方法所不能提供的信息。准确掌握发酵液微生物组成结构对于深入了解酸菜发酵机理、指导生产以及筛选高效酸菜发酵菌剂都有重要意义。

4 结论

本研究以传统东北酸菜为对象，采用构建16S rRNA基因克隆文库的方法研究了酸菜成熟发酵液中细菌的多样性和群落的组成结构。酸菜发酵液中含有的主要微生物种类为Lact.coryniformis、P.parvulus、Citr.murliniae、Clos.intestinale、Lact.malefermentans、Lact.plantarum、Leuc.citreum、A.spanius和 E.cloacae。其中，乳酸杆菌属(Lactobacillus)、片球菌属(Pediococcuss)和枸橼酸杆菌属(Citrobacter)为优势菌，分别占64.29%，22.45%和8.16%。

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