吡格列酮对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠骨代谢指标及骨密度的影响

邸 倩，邱明才，张 鑫，杨 静(山西医科大学第一临床医学院内分泌科，太原 03000;天津医科大学总医院内分泌科)

吡格列酮为噻唑烷二酮类药物(TZDs)，噻唑烷二酮类药物是治疗糖尿病的一类新药，主要通过激活PPAR-γ(过氧化物酶酶体增殖受体)，增加多种基因编码蛋白的表达［1］，从而提高胰岛素敏感性。近来有研究表明，TZDs可能导致骨量减少，可能增加骨折的风险［2］，但也有报道，TZDs不影响骨转换及骨密度［3］。本文探讨不同剂量PIO干预影响糖尿病大鼠骨代谢指标及骨密度。

1 材料与方法

1．1 实验对象与材料

1．1．1 实验动物 采用鼠龄相同、平均体重约240 g的雄性SD大鼠38只［二级，实验动物质量合格证编号:SGCK(京)2008－0001］，由中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所实验动物中心提供。标准颗粒饲料喂养，自然昼夜光线照明，室内相对湿度40%－70%，室温保持于20－25℃。实验期间动物自由饮水、进食。

1．1．2 主要药物和试剂 链脲佐菌素(美国Sigma公司)、微量血糖试纸(罗氏诊断有限公司)、PIO(北京太洋有限公司)

1．1．3 实验所用检测试剂盒 血清钙磷、尿钙检测试剂盒(邻甲酚肽络合酮检测试剂盒，通用型):中生北控生物科技股份有限公司;血碱性磷酸酶检测试剂盒(通用型):中生北控生物科技股份有限公司。

1．1．4 主要仪器 ACCT-CHECK Active血糖仪(罗氏诊断有限公司)、TN-100B型托盘扭力天平(上海第二天平仪器厂)、半自动生化分析仪(荷兰Vital Scientific公司)、PRODYIGY型双能X线骨密度仪。

1．2 实验方法

1．2．1 实验分组 选取平均体重约为240 g的雄性SD大鼠38只，随机选择10只为正常对照组，其余28只大鼠为造模成功的大鼠，按血糖和体重分层，随机分为PIO小剂量治疗组(4 mg/(kg·d)，n=10)、PIO 大剂量治疗组(20 mg/(kg·d)，n=8)、DM未治疗组(n=10)。造模前夜，大鼠自由进食水。造模当日实验动物称重，将大鼠置于鼠盒，酒精棉球擦拭大鼠尾部使尾静脉暴露，按照45 mg/kg尾静脉一次注射STZ(以0．1 mol/L pH 4．2的无菌枸橼酸－枸橼酸钠缓冲液配制成浓度为2%的溶液)，1 ml注射器穿刺尾静脉，见回血后30 s内匀速完成推注。给药后72 h和1周后测定大鼠尾静脉血糖，血糖两次均大于16．7 mmol/L判定为DM造模成功。正常对照组大鼠仅尾静脉注射等体积的枸橼酸－枸橼酸钠缓冲液。全部动物于成模后干预16周处死。干预期间未应用吡格列酮之外的降糖药物，每日上午9∶00时给药，吡格列酮混悬液灌胃服用。干预期间无因血糖原因死亡大鼠。

1．2．2 大鼠一般状况检测 每周检测大鼠体重;成模后每月经内眦静脉取血，应用血糖仪检测大鼠血糖;处死前留取24 h尿，记录尿量，以备测定24 h尿钙，24 h尿磷。

1．2．3 血清钙、磷，24 h尿钙检测 采用邻甲酚肽络合铜比色法检测血尿钙水平。

1．2．4 血清骨转换标志物检测 血清碱性磷酸酶(alkaline phosphotase，ALP)的测定:处死前经股动脉取血，分离血清，－20℃保存。在VITALAB-micro半自动生化分析仪上采用连续监测法检测血清ALP的酶活度。

1．2．5 骨密度测定 测量时将股骨和椎骨(L1－5)放在一个小动物平台上，沿平台的长轴放置。BMD测定用美国Lunar公司的Prodigy型DEXA骨密度仪，配备小动物测量软件，仪器测定质控体模的变异系数为0．09%。

1．3 统计学处理

2 结果

2．1 各组大鼠血清钙磷比较

处死前股动脉放血收集血标本，离心后收集血清，用邻甲酚酞络合铜比色法测定各组大鼠处死前血钙水平。结果发现，各组大鼠之间血清钙水平差异无统计学意义(P＞0．05)。同时测定大鼠处死前血清磷水平，各组大鼠之间血清磷水平差异无统计学意义(P ＞0．05，见表1)。

2．2 各组大鼠24尿量和24 h尿钙比较

处死前留取各组大鼠24 h尿，记录尿量，用邻甲酚肽络合铜比色法测定各组大鼠24 h尿钙水平。结果发现，各DM组大鼠24 h尿量显著高于正常对照组(P＜0．05)，且组间差异无统计学意义(P＞0．05)。24 h尿钙水平比较显示，不同剂量组和未治疗组大鼠24 h尿钙显著高于正常对照组(P＜0．05)，且三组间差异无统计学意义(P＞0．05，见表1)。

2．3 各组大鼠血清碱性磷酸酶(ALP)水平的比较

处死前股动脉放血收集血标本，用半自动生化分析仪测定ALP酶活度，结果发现，各组大鼠血清碱性磷酸酶水平差异无统计学意义(P＞0．05，见表1)。

表1 各组大鼠血清Ca、P、ALP、24 h尿量、尿钙比较(±s)Table 1 Comparison of serum Ca，P and ALP，and 24 h urine volume and urine Ca，among four groups(±s)

表1 各组大鼠血清Ca、P、ALP、24 h尿量、尿钙比较(±s)Table 1 Comparison of serum Ca，P and ALP，and 24 h urine volume and urine Ca，among four groups(±s)

与对照组相比，★P ＜0．01

组别 n Ca(mmol/L) P(mmol/L) 24 h尿量(ml) 24 h尿钙(mg) ALP(U/L)低剂量组 10 2．52 ±0．06 1．64 ±0．10 98．70 ±5．75★ 16．09 ±5．62★166．3 ±6．24高剂量组 10 2．51 ±0．09 1．64 ±0．07 97．40±4．82★ 16．32 ±2．32★ 163．5±7．34未治疗组 8 2．52 ±0．11 1．65 ±0．06 99．51±11．96★ 17．03 ±3．92★ 164．1±5．62对照组 10 2．54 ±0．08 1．63 ±0．06 30．80 ±3．37 2．98 ±0．58163．7 ±6．68

2．4 各组大鼠骨密度(BMD)的比较

用DEXA双能X线骨密度仪测定各组大鼠骨密度，结果提示，DM各组与对照组比较，股骨和腰椎骨密度均有统计学差异(P＜0．01)。高剂量组股骨和腰椎骨密度低于其他三组(P＜0．05，见表2)。

与对照组相比，低剂量组大鼠股骨骨密度减低2．25%，高剂量组减低3．93%，未治疗组减低1．69%。与未治疗组相比，高剂量组减低2．29%;与低剂量组相比，高剂量组减低1．72%。

与对照组相比，低剂量组大鼠腰椎骨密度减低3．03%，高剂量组减低4．04%，未治疗组减低2．53%。与未治疗组相比，高剂量组减低1．55%，余各组差异无统计学意义。与低剂量组相比，高剂量组减低1．04%。

表2 各组大鼠骨密度比较(±s)Table 2 Comparison of the body mineral density among four groups(±s)

表2 各组大鼠骨密度比较(±s)Table 2 Comparison of the body mineral density among four groups(±s)

与对照组相比，★P ＜0．01;与未治疗组相比，△P ＜0．05;与低剂量组相比，#P ＜0．05

组别 n 股骨骨密度(g/cm2) 腰椎骨密度(g/cm2)低剂量组 10 0．174±0．013★ 0．192±0．009★10 0．178 ±0．012 0．198 ±0．011高剂量组 10 0．171 ±0．009★△# 0．190 ±0．004★△#未治疗组 8 0．175±0．008★ 0．193±0．011★对照组

3 讨论

实验结果提示，各PIO干预组对DM大鼠的血钙、磷水平均差异无统计学意义。最近一项临床研究显示，PIO干预对糖尿病患者的血钙、磷指标无显著影响，与本研究结果一致［4］。各 PIO干预组对DM大鼠的24 h尿钙水平均无显著影响。考虑与以下因素有关:①本实验DM大鼠模型近似于1型DM，PIO干预对血糖及胰岛素敏感性均无显著影响，因此，对DM大鼠尿糖增高的渗透性利尿及胰岛素绝对缺乏造成的钙盐丢失无显著影响。②可能PIO有与罗格列酮相似的作用抑制IGF－Ⅰ造成钙盐丢失。Sugimoto等［5］在体外实验以罗格列酮(1 μmol/L)作用于骨髓细胞(UAMS－33)，减少了胰岛素样生长因子－Ⅰ(IGF－Ⅰ)、IGF－Ⅱ、IGF结合蛋白(IGF－BP4)及IGF－Ⅰ受体、IGF－Ⅱ受体的表达;体内实验以罗格列酮［(20 mg/(kg·d)］作用于B6鼠抑制了骨及肝脏IGF－Ⅰ水平。③PIO干预对DM大鼠肾脏有保护作用，因此，减弱了1α羟化酶受损造成的尿钙重吸收减少。PIO干预对DM大鼠的24 h尿钙水平影响是多种因素综合影响的结果。

吡格列酮干预组无论低剂量或高剂量组分别与DM组相比，血清碱性磷酸酶水平均无统计学差异。这可能是因为通常采用的测定方法反映的是总碱性磷酸酶的水平。血清碱性磷酸酶来源广泛，骨、肝、肠、肾等部位均可分泌，因而缺乏组织特异性。

结果提示，高剂量PIO组干预导致大鼠股骨及腰椎(L1－L4)骨密度均减少，而低剂量PIO组干预对大鼠骨密度未造成影响。既往有关TZDs对DM骨转换及骨密度影响的研究较少且颇具争议。Lecka-Czernik等［6］以罗格列酮［20 mg/(kg·d)］干预C57BL/6J(B6)鼠体内实验做出与本实验相一致的结果。也有认为，TZDs改善血糖而减低了DM骨转换，机体BMD增加，而这种骨转换的减低发生在血糖改善之前，提示TZDs可能对骨有直接作用［7］。最近丹麦Syversen等给予未去除卵巢的完整雌鼠(Fischer－344)吡格列酮［35 mg/(kg·d)］，治疗4个月发现大鼠股骨及腰椎骨密度均减低，与本实验结果一致［8］。一项研究显示，小剂量吡格列酮［3 mg/(kg·d)］干预链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠，不影响骨密度，骨吸收及骨代谢，与本实验结果一致［9］。Lecka-Czernik等［10］的骨髓干细胞培养与罗格列酮［20 mg/(kg·d)］干预C57BL/6J(B6)鼠体内实验显示，大鼠骨小梁体积减少，通过骨形成速率减低造成骨量减少。也有研究显示不同的结果。Syversen等［8］给予未去除卵巢的完整雌鼠(Fischer－344)吡格列酮35 mg/(kg·d)治疗4个月发现大鼠骨小梁体积减少，该实验中细胞培养也未能显示任何与罗格列酮类似的影响前成骨细胞分化的作用，而仅表现为血清OPG减低，推测PPARγ激动剂可能主要对骨吸收起作用。有研究表明，这种结果差异可能与TZDs激活PPARγ的活性不同有关［11］。较为公认的是，TZDs减低骨密度及形成“脂肪骨”，至少部分是因为间充质细胞从骨生成方向脱离向脂肪生成分化［12］。

综上所述，TZDs可能减低骨密度，宜小剂量使用，使用选择性PPARγ调节剂(SPPARγMs)或许是将来的一个新的研究方向［13］。当然，还需大规模的实验进一步证实。

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