特发性肺纤维化患者外周血Th17细胞变化及其临床意义

史红阳，刘 昀，方 萍，张德信(西安交通大学第二附属医院呼吸内科，西安 710004;通讯作者，E-mail:shihy2003@126．com)

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种病因未明的肺间质性疾病，主要表现为弥漫性肺泡炎、肺泡单位结构紊乱和肺间质纤维化，其病理改变以大量的成纤维细胞聚集、细胞外基质沉积并伴有炎症和组织损伤所致的结构破坏为特征，病变局限于肺部，引起弥漫性肺纤维化，导致肺功能损害和呼吸困难。目前缺乏特效治疗手段，主要应用糖皮质激素或其他免疫抑制剂治疗，预后很差，经过数月至数年发展为呼吸衰竭和肺心病，起病后平均存活时间为2．8-3．6年。发病机制尚未完全阐明，研究发现遗传因素、病毒感染、特异质、环境因素、自身免疫等因素都与特发性肺纤维化的发病有关，其中感染和自身免疫发挥了重要的作用［1-4］。Th17细胞是在研究自身免疫性疾病过程中逐渐发现的一类Th细胞亚群，目前普遍认为Th17细胞是一种独立的细胞亚群，在炎症、自身免疫病、肿瘤、移植免疫等过程中发挥重要作用［5-7］。国内外学者通过实验发现肺纤维化动物模型肺组织中Th17细胞数量及外周血中IL-17水平明显增高，提示Th17细胞及IL-17可能在肺纤维化发病过程中发挥了重要作用［8-17］。RORγt是视黄醇家族成员之一，研究表明RORγt是Th17细胞分化过程中关键的转录激活因子。RORγt缺陷小鼠的CD4+胸腺细胞数量均减少，缺乏淋巴结、集合淋巴滤泡和淋巴组织诱导细胞，Th17细胞分化被抑制，发生实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)等自身免疫性疾病的严重程度减轻。同时，过表达 RORγt促进了 IL-17的合成［18］。本实验检测特发性肺纤维化患者外周血Th17细胞百分率、RORγt mRNA表达水平及血浆中IL-17的水平，初步探讨Th17细胞在特发性肺纤维化发病中的作用，进而为特发性肺纤维化的临床早期诊断和治疗提供理论和实验依据。

1 对象与方法

1．1 研究对象

选取2014-01～2014-12在我院呼吸内科住院确诊的特发性肺纤维化患者38例，其中男性25例，女性13例，年龄36-71岁，平均年龄(59．6±11．7)岁。所有病例诊断均符合2011年美国胸科协会(ATS)、欧洲呼吸学会(ERS)、日本呼吸学会(JRS)和拉丁美洲胸科学会(ALAT)共同推荐的IPF诊治共识中的IPF诊断标准［19］。排除标准:①其他已知原因导致的肺纤维化(包括家庭、职业环境暴露相关的肺纤维化、结缔组织病继发的肺纤维化、药物及放射相关的肺纤维化);②合并恶性肿瘤;③合并或诊断为慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘、支气管扩张、肺脓肿、活动性肺结核、肺癌、结节病等;④合并严重的心脏、肝脏、肾脏及血液系统疾病;⑤近期合并感染性疾病;⑥妊娠或哺乳期妇女;⑦合并精神疾病。

选取40例同期在我院进行健康体检的健康者作为正常对照组，其中男性25例，女性15例，年龄38-66岁，平均年龄(55．8±10．7)岁。两组研究对象性别、年龄的比较差异均无统计学意义(P＜0．05)。本研究得到我院伦理委员会批准并取得所有研究对象的知情同意。

所有患者均在进行糖皮质激素及其他免疫抑制剂治疗前采样，无菌采取EDTA抗凝静脉血5．0 ml，500×g离心10 min后分离血浆，-86℃保存，用于ELISA检测。利用人淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，制备成浓度为1×106个/ml的单细胞悬液，一部分用于流式细胞检测，一部分用于 PCR检测。

1．2 方法

1．2．1 流式细胞术检测Th17细胞百分率:取250 μl单细胞悬液，加入佛波酯(终浓度50 ng/ml)、离子霉素(终浓度500 ng/ml)37℃，5%CO2条件下培养2 h后加入BD GolgiPlug蛋白转运抑制剂(终浓度1 μl/ml)，混匀后继续培养4 h。PBS洗涤后500×g 离心 5 min，弃上清液，加入 20 μl FITC-CD4 抗体，温和混匀，常温下避光孵育20 min。PBS洗涤后500 ×g 离心5 min，弃上清液，加入 250 μl固定/破膜液，4℃避光孵育20 min。洗涤细胞后加入20 μl Alexa Fluor®647-IL-17抗体或同型对照抗体，轻轻混匀，室温避光孵育20 min。PBS洗涤细胞后重悬细胞上流式细胞仪检测，以CD4+T细胞设门进行分析。

1．2．2 实时定量 RT-PCR检测RORγt mRNA的表达水平 取1．0 ml细胞悬液，500×g离心10 min，加入1．0 ml Trizol液提取细胞总 RNA，将提取的RNA用30．0 ml DEPC水溶解，-80℃保存备用。利用逆转录试剂盒合成cDNA第一链，具体如下:3．0 μl总 RNA、1．0 μl Oligo(dT)及 9．0 μl双蒸水，混匀后70℃孵育5 min，冰上冷却，依次加入5×反应缓冲液 4．0 μl、20 U/μl RNase 抑制剂 1．0 μl及10 mmol/L dNTP 2．0 μl，37 ℃孵育5 min。加入200 U/μl M-MuLV 逆转录酶 1 μl，42 ℃ 孵育 60 min，70℃孵育10 min，冰上冷却终止反应。合成的cDNA第一链在-20℃保存。根据RORγt、GAPDH基因序列，利用Primer Premier 5．0软件设计，基因及引物系列、产物大小见表1。20 μl PCR反应体系包括SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(2 × )10 μl、PCR 上下游引物(10 μmol/L)各 1．0 μl、DNA 模板 2．0 μl、双蒸水6．0 ml。两步法PCR扩增程序如下:95℃ 30 s预变性，95℃ 5 s、60℃ 30 s共35个循环。PCR扩增结束后获得循环阈值(CT值)，2-ΔΔCt分析目的基因mRNA的相对表达。ΔΔCt=实验组ΔCt(目的基因Ct-内参基因Ct)-对照组ΔCt(目的基因Ct-内参基因Ct)。

表1 基因及引物序列Table 1 Gene and primer sequence

1．2．3 酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测血浆 IL-17水平 利用ELISA试剂盒检测IL-17水平，每个样本做3个复孔，严格按照试剂盒说明进行操作。

1．3 统计学方法

2 结果

2．1 特发性肺纤维化患者外周血Th17细胞百分率的比较

流式细胞术结果显示特发性肺纤维化患者外周血Th17细胞百分率为(1．26±0．29)%，与正常对照组(0．95±0．21)%相比明显增高，差异有统计学意义(t=5．427，P=0．000，见图1)。

图1 IPF患者外周血Th17细胞百分率Figure 1 The percentage of Th17 cells in peripheral blood of patients with IPF by flow cytometry

2．2 特发性肺纤维化患者外周血RORγt mRNA及血浆IL-17水平的比较

荧光定量PCR结果显示特发性肺纤维化患者RORγt mRNA表达水平较正常对照明显增高(P＜0．05);ELISA结果显示特发性肺纤维化患者血浆IL-17水平明显高于正常对照，差异有统计学意义(P ＜0．05，见表2)。

表2 IPF患者与正常对照组外周血RORγt mRNA及IL-17水平的比较(±s)Table 2 Comparison of RORγt mRNA and IL-17 levels between peripheral blood of patients with IPF and normal controls(±s)

表2 IPF患者与正常对照组外周血RORγt mRNA及IL-17水平的比较(±s)Table 2 Comparison of RORγt mRNA and IL-17 levels between peripheral blood of patients with IPF and normal controls(±s)

组别 n RORγt mRNA IL-17(pg/ml)40 0．41 ±0．19 23．64 ±9．51特发性肺纤维化组 38 0．67 ±0．28 41．85 ±16．27 t 4．820 6．071 P正常对照组0．000 0．000

3 讨论

辅助性T细胞(help T lymohocyte，Th)在机体免疫系统发挥免疫防御和自稳过程中发挥重要的作用，1986年 Mossman等［20］先发现 CD4+T 细胞可分为两个细胞亚群，分泌IFN-γ的Th1细胞亚群和分泌IL-4的Th2细胞，随后在研究自身免疫性疾病过程中逐渐发现了另一类Th细胞亚群-Th17细胞，越来越多的研究证实Th17细胞是一种独立的细胞亚群。目前研究证实Th17细胞的分化过程需要经过诱导、扩增、稳定/维持3个步骤，在不同的阶段需要不同的细胞因子，在诱导阶段主要需要TGF-β和IL-6的共同作用，新分化的Th17细胞分泌IL-21，而IL-21可以促进Th17细胞的扩增，随后Th17细胞在IL-23的作用下来保持稳定。Th17细胞主要产生IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-26(人)、CCL20 等细胞因子，其中IL-17A是最主要的效应分子，属于促炎症因子，最初Th17细胞的功能是作为适应性免疫的一个分支清除Th1和Th2细胞免疫无法处理的特定类型的病原体，革兰氏阳性菌和真菌感染均能引起强烈的Th17细胞应答，随后的研究发现Th17细胞在炎症、自身免疫病、肿瘤、移植免疫中发挥重要作用［5-7］。

特发性肺纤维化是一种复杂的进行性病变，发病机制尚未清楚，炎症反应和自身免疫在其发病过程中的作用越来越受到重视。国外学者首先在研究肺的囊性纤维化时提出Th17、IL-17与肺纤维化有关［21］。近年来国内外学者通过肺纤维化动物模型发现肺组织中Th17细胞数量及外周血中IL-17水平明显增高，提示Th17细胞及IL-17可能在肺纤维化发病过程中发挥了重要作用［8-17］。为了探讨Th17细胞在特发性肺纤维化中的作用，本实验利用流式细胞术检测了特发性肺纤维化患者外周血中Th17细胞百分率，结果发现特发性肺纤维化患者外周血Th17细胞细胞百分率与正常对照组相比明显增高，差异有统计学意义(P＜0．05)，这与国内外学者动物实验研究结果基本一致［8-17］。本研究还检测了特发性肺纤维化患者外周血中RORγt mRNA表达水平，结果显示特发性肺纤维化患者RORγt mRNA表达水平较正常对照组明显增高(P＜0．05)，这与外周血中Th17细胞百分率结果一致，进一步证实了特发性肺纤维化患者外周血中Th17细胞百分率增高。由于Th17细胞产生大量的IL-17，所以Th17细胞介导的效应主要是通过IL-17来发挥作用的，IL-17与其受体结合后可以诱导效应细胞产生多种炎性细胞因子和趋化因子，参与多种炎性疾病及自身免疫性疾病发病过程。我们的实验发现特发性肺纤维化患者血浆IL-17水平明显高于于正常对照组(P＜0．05)，这也与动物实验结果一致［10，11］。

综上所述，特发性肺纤维化患者体内的Th17细胞数量增多，分泌IL-17也增多，Th17细胞在特发性肺纤维化发生、发展过程发挥一定作用，同时IL-17以及RORγt亦可能在肺纤维化的发生发展中发挥着作用。既往关于特发性肺纤维化患者外周血中Th17细胞百分率检测的相关研究较少，本实验通过检测患者血中Th17细胞百分率及RORγt mRNA水平，亦同时检测了血浆中IL-17的水平，具有一定的创新性。目前，导致特发性肺纤维化患者Th17细胞异常的具体机制尚不明确。因此，进一步研究Th17细胞及IL-17在特发性肺纤维化中的作用，可能为早期诊断及临床治疗特发性肺纤维化提供新的靶点。

［1］Wolters PJ，Collard HR，Jones KD．Pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis［J］．Annu Rev Pathol，2014，9:157-179．

［2］Ryu JH，Moua T，Daniels CE，et al．Idiopathic pulmonary fibrosis:evolving concepts［J］．Mayo Clin Proc，2014，89(8):1130-1142．

［3］Antoniou KM，Margaritopoulos GA，Siafakas NM．Pharmacological treatment of idiopathic pulmonary fibrosis:from the past to the future［J］．Eur Respir Rev，2013，22(129):281-291．

［4］Chakraborty S，Chopra P，Ambi SV，et al．Emerging therapeutic interventions for idiopathic pulmonary fibrosis［J］．Expert Opin Investig Drugs，2014，23(7):893-910．

［5］Zambrano-Zaragoza JF，Romo-Martínez EJ，de Durán-Avelar M J，et al．Th17 cells in autoimmune and infectious diseases［J］．Int J Inflam，2014，2014:651503．

［6］Wilke CM，Bishop K，Fox D，et al．Deciphering the role of Th17 cells in human disease［J］．Trends Immunol，2011，32(12):603-611．

［7］McDonald DR．TH17 deficiency in human disease［J］．J Allergy Clin Immunol，2012，129(6):1429-1435;

［8］François A，Gombault A，Villeret B，et al．B cell activating factor is central to bleomycin-and IL-17-mediated experimental pulmonary fibrosis［J］．J Autoimmun，2015，56:1-11．

［9］Fabro AT，da Silva PH，Zocolaro WS，et al．The Th17 pathway in the peripheral lung microenvironment interacts with expression of collagen V in the late state of experimental pulmonary fibrosis［J］．Immunobiology，2015，220(1):124-135．

［10］Chen Y，Li C，Weng D，et al．Neutralization of interleukin-17A delays progression of silica-induced lung inflammation and fibrosis in C57BL/6 mice［J］．Toxicol Appl Pharmacol，2014，275(1):62-72．

［11］Tan HL，Rosenthal M．IL-17 in lung disease:friend or foe［J］．Thorax，2013，68(8):788-790．

［12］Song L，Weng D，Liu F，et al．Tregs promote the differentiation of Th17 cells in silica-induced lung fibrosis in mice［J］．PLoS One，2012，7(5):e37286．

［13］Dong Z，Tai W，Yang Y，et al．The role of all-trans retinoic acid in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice［J］．Exp Lung Res，2012，38(2):82-89．

［14］赖小映，钟小宁．Th17、Treg在肺纤维化小鼠外周血、肺组织中的表达及意义［J］．山东医药，2013，53(19):1-4．

［15］万勇，张念，李剑平，等．调节性T细胞与Th17细胞的失衡及其对大鼠肺纤维化的影响［J］．华中科技大学学报:医学版，2013，42(2):161-167．

［16］李树民，鲍文华，穆晓春，等．Th17细胞在肺纤维化大鼠模型中的表达［J］．重庆医科大学学报，2013，38(7):780-784．

［17］鲍文华，李树民，穆晓春，等．Th17细胞、RORγt在肺纤维化大鼠模型中的表达及意义［J］．临床肺科杂志，2013，18(6):1075-1078．

［18］Ivanov II，McKenzie BS，Zhou L，et al．The orphan nuclear receptor ROR gamma-t directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+T helper cells［J］．Cell，2006，126(6):1121-1133．

［19］Raghu G，Collard HR，Egan JJ，et al．ATS/ERS/JRS/ALAT Committee on Idiopathic Pulmonary Fibrosis．An official ATS/ERS/JRS/ALAT statement:idiopathic pulmonary fibrosis:evidencebased guidelines for diagnosis and management［J］．Am J Respir Crit Care Med，2011，183(6):788-824．

［20］Mosmann TR，Cherwinski H，Bond MW．Two types of murine helper T cell clone．I．Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins［J］．J Immunol．，1986，136(7):2348-2357．

［21］Tan HL，Regamey N，Brown SP，et al．The Th17 pathway in cystic fibrosis lung disease［J］．Am J Respir Crit Care Med，2011，184(2):252-258．