针刺对肥胖大鼠Lee’s指数、胰岛素、瘦素和SOCS 3水平的影响▲

唐红珍 蒋凌风 陈丹丹 梁 媚 黄鸿腾 张昭阳 刘 佳

(广西中医药大学，南宁市 530001)

单纯性肥胖病是由于机体能量摄入超过消耗，导致体内脂肪积聚过多的一种病理状态［1］。肥胖可以导致多种危险性病症，如冠心病、高血压、高脂血症、2型糖尿病、脑卒中等［1，2］，严重影响人类健康。因此，预防和治疗肥胖已成为全球重大的公共卫生挑战。据统计，我国体重超重的比例达 22．4% ，肥胖者为 3．01%［3，4］。关于肥胖的治疗，现代医学尚缺乏特别有效的策略及干预措施，近年采用传统中医药方法治疗取得了显著效果，特别是针刺减肥以其疗效显著、无毒副作用而成为临床最为普遍的治疗选择之一［5］。一些研究已阐释了中医针刺减肥具有多层次、多靶点干预效应［6，7］，但其具体作用机制尚不清楚。在肥胖发病机制研究中，胰岛素抵抗(Insulin resistance，IR)及瘦素抵抗(Leptin resistance，LR)作为肥胖发生的重要危险因素已被广泛认可［8～10］。IR和LR存在着共同调节关键点:细胞因子信号抑制剂3(Suppressor of cytokinesignaling-3，SOCS3)，可通过信号转导机制调节体内胰岛素、瘦素水平。本研究探讨针刺对肥胖大鼠血清瘦素、胰岛素和SOCS3水平的影响，以期阐释针灸减肥的作用机制，为针刺治疗肥胖病提供实验依据。

1 材料及方法

1．1 材料与试剂

1．1．1 实验动物 SPF级健康雄性SD大鼠70只，体重180～210 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供［许可证号:SCXK(湘)2013-0004］。

1．1．2 饲料配制

1．1．2．1 普通饲料 由广西中医药大学实验动物中心提供。营养成分符合GB/T14924．10-2001标准，具体营养成分指标为:水分10%，粗蛋白质18%，粗脂肪4%，粗纤维5%，粗灰分8%，钙1．0% ～1．8%，钙:磷比为1．2 ∶1 ～1．7 ∶1。

1．1．2．2 高脂饲料(配比) 猪油10%，全脂奶粉3%，白糖5%，鸡蛋5%，胆固醇1%，猪胆酸0．25%，其余为普通饲料。

1．1．3 主要试剂和仪器 大鼠瘦素(LEP)测试盒、细胞因子信号转导抑制因子3(SOCS3)ELISA试剂盒(南京建成科技有限公司);大鼠胰岛素(Insulin)测试盒(武汉博士德生物工程有限公司);针具选苏州产掀针，规格0．22 mm ×1．5 mm。

1．1．4 主要仪器 全波长酶标仪:EPOCH BIOTEK(编号:20110793);eppendorf离心机。

1．2 方法

1．2．1 动物造模方法 70只SD大鼠普通饲料适应性喂养3 d后，按1∶6的比例随机分为普通饲料组(10只)、高脂饲料组(60只)，普通饲料组喂食普通饲料，高脂饮食组喂食高脂饲料，两组均连续喂养6周。高脂饮食60只大鼠中，有47只大鼠体重超过普通饮食组大鼠平均体重20%以上，达到模型复制要求［11］。

1．2．2 大鼠分组及针灸干预方法 以普通饲料喂养的10只大鼠作为空白对照组，从符合模型标准的47只大鼠中选择体重相近大鼠30只，随机分为:①特定穴位针刺组(10只):取中脘、关元、足三里(双侧)、天枢(双侧)、丰隆(双侧)、阴陵泉(双侧)，刺入深度3～5 mm;②非特定穴位针刺组(10只):取上穴旁开0．5寸非经非穴处进行针刺，留针30 min，1次/d;③模型对照组(10只):模型对照组实行等时(与干预组相同时间)捆绑固定;④空白对照组(10只):给予常规饲养，不行针刺或捆绑干预。

1．2．3 饲养条件 所有大鼠在饲养过程中，饲养室温(22±1)℃，空气湿度(50% ±4．7%)，自由饮水，不限制饲料量，12/12昼夜循环，干预4周。

1．3 观测指标及方法 期间每周检测记录所有大鼠体重、体长、Lee’s指数。治疗后，麻醉大鼠，腹主动脉采血分离血清，采用酶联免疫法检测血清相关指标(所有测定步骤严格按照试剂盒说明书操作)。

1．4 统计学处理 数据采用SPSS 15．0软件处理，计量资料以均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，干预前后比较采用配对 t检验。以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 动物模型制备 动物分组时，普通饲料组与高脂饮食组大鼠体重无统计学差异(P＞0．05);经过6周饮食诱导后，高脂饮食组大鼠体重明显重于普通饲料组，差异有统计学意义(P＜0．05)，其中高脂饮食组大鼠体重超过普通饮食组平均体重20%的大鼠共47只。肥胖诱导大鼠模型达到实验预期目标，模型复制成功。见表1。

表1 不同饲料诱导大鼠体重比较

2．2 针刺干预对大鼠体重的影响 各组在实验第0周(造模前)，体重无明显统计学差异(P＞0．05)，实验第6周(造模结束)阶段，模型对照组、特定穴针刺组、非特定穴针刺组体重均显著高于空白对照组(P＜0．01)，但三组之间比较，无明显统计学差异(P＞0．05)，经过连续5周的干预处理后，特定穴位针刺组、非特定穴位针刺组体重明显高于模型对照组(P＜0．01)，且特定穴位针刺组体重明显高于非特定穴位针刺组(P＜0．05)。见表2。

表2 不同组大鼠干预前后体重比较

2．3 针刺对大鼠Lee’s指数的影响 第6周造模结束时，模型对照组、特定穴位针刺组、非特定穴位针刺组大鼠Lee’s指数比较，差异无统计学意义(P＞0．05);经过4周的干预处理后，特定穴位针刺组和非特定穴位针刺组大鼠Lee’s指数明显低于模型对照组(P＜0．01)，且特定穴位针刺组明显低于非特定穴位针刺组(P ＜0．05)。见表3。

2．4 大鼠血清胰岛素、瘦素、SOCS3含量 模型对照组的血清胰岛素、瘦素及SOCS3含量与空白对照组比较均有显著升高(P＜0．05)，提示高脂饲料诱导的肥胖大鼠胰岛素、瘦素及SOCS3含量，存在胰岛素、瘦素抵抗;而针刺治疗后，非特针组、特针组大鼠的血清胰岛素、瘦素及SOCS3含量与模型对照组对比均有统计学意义(P＜0．05)，提示针刺能缓解肥胖大鼠高瘦素血症、高胰岛素血症，并可能与SOCS3调控有关。见表3。

表3 针刺对大鼠Lee’s指数胰岛素、瘦素和SOCS3的影响 (n=10)

3 讨论

肥胖是体内脂肪堆积过多和(或)分布异常的一种状态。单纯性肥胖(以下简称肥胖)是指无明显内分泌代谢疾病等病因可寻的肥胖症，约占所有肥胖病的95%以上。鉴于饮食富营养化是肥胖形成的主要病因，现阶段最常研究的肥胖动物模型是营养型肥胖大鼠模型，因与人类高脂饮食引起的肥胖有许多相似特征，所以被广泛应用于肥胖和减肥药的实验研究［12，13］，本研究采用高脂饮食诱导模仿人体肥胖病因，通过该方法复制肥胖模型。研究通常以体重指数(BMI)作为衡量人体肥胖的指标，而大鼠则常用Lee’s指数衡量肥胖度。本实验检测了大鼠体重、Lee’s指数，研究发现，经过连续7周的高脂饮食喂养后，高脂饮食组大鼠体重、Lee’s指数等明显高于普通饮食组大鼠，与杨晓姣等［14］研究结果类似，最后选择体重超过正常大鼠体重20%者为肥胖模型对照组大鼠，达到预期目标。

在肥胖的发病机制中，瘦素是肥胖基因(obese gene)表达产物，具有抑制食欲、减少食物摄入、增加能量消耗的作用，使机体不至于过度肥胖［15，16］。但研究表明大多数肥胖者和啮齿类动物中血清瘦素不但不降低反而表现为高瘦素血症［17，18］，血清中瘦素水平与肥胖程度呈正相关，提示瘦素与肥胖症发病密切相关，瘦素不能正常发挥其减轻体重的作用，其对瘦素的反应减弱或无反应而呈现明显的瘦素抵抗现象。在老龄鼠中，高瘦素血症可使SOCS-3浓度升高达幼鼠的3倍，使瘦素抵抗增加，脂肪含量增加1．5倍［19］。而瘦素又能抑制胰岛素表达、分泌，同时瘦素对脂肪分解作用本身也加重了胰岛素抵抗，特别是肥胖患者体内高胰岛素血症引起高瘦素血症，加剧了胰岛素抵抗，最终可导致瘦素抵抗［20］。

SOCS3是由3个研究小组分别采用不同方法发现的，也称为细胞因子信号转导抑制因子，他主要通过抑制JAK/STAT通路对细胞因子进行负反馈调节，被称为细胞的“分子刹车”。SOCS3属于SOCS家族，与肥胖、2型糖尿病等疾病的发生发展密切相关。SOCS3可以调节中枢瘦素敏感性，瘦素诱导SOCS3的表达，而SOCS3又可作为瘦素信号的负性调节因子。同时，SOCS3还参与了多种状态下及多种激素或大分子引起的胰岛素抵抗的形成过程。Lebrun等［21］认为，SOCS3蛋白是通过以下机制抑制胰岛素信号通路的:①通过竞争IR上的作用位点而抑制IRS的酪氨酸磷酸化;②通过SOCS盒靶向作用结合IRS并使之泛素化，从而易于被蛋白酶体识别和降解，降低IRS水平，影响胰岛素信号传导;③抑制胰岛素受体酪氨酸激酶的活性。

综上可见，SOCS3蛋白可以抑制瘦素和胰岛素的信号通路，影响能量平衡和葡萄糖内环境稳定，与肥胖的发生发展有密切联系。针刺是治疗肥胖的有效手段之一，大量动物实验发现［22，23］针刺有良好减肥疗效的同时，还能减少胰岛素含量，因此，我们认为，针刺有可能通过SOCS3的变化来影响胰岛素抵抗和瘦素抵抗。这一问题也是本研究亟需通过实验验证的关键问题。

课题组前期采用固本培元、健脾和胃法选穴治疗肥胖发现，超重及肥胖者经针刺治疗后，腹腰围、大腿围明显减少、体重明显减轻，总有效率达到86．7%，且具有起效时间快、安全性高等优势［24，25］。故选择足三里、中脘、天枢、丰隆、阴陵泉、关元等穴位作为治疗肥胖的配方，方中足三里为胃经合穴，是治疗脾胃病主穴;天枢居于脐旁，是大肠募穴，通于中焦，两穴合用有斡旋上下、司升降之功;丰隆是足阳明胃经之络穴，络于足太阴脾经，具有健脾化湿之功，是治痰要穴。关元位于下焦，为任脉穴、小肠募穴，小肠主精微吸收功能，是脾主运化和升清功能实现的重要体现。关元系三阴与任脉之会穴，可调节肝、脾、肾以及任脉的功能，且具有补益下焦之气的功用。阴陵泉可调真元，通利三焦，清利小便。以上诸穴相配，表里同治，标本兼顾，既可促进脾升胃降，又可补气助阳益肾，推动全身气机运行，促使气充体旺，痰化浊去，达到消脂减肥之目的。

本研究显示:高脂饲料诱导的肥胖大鼠血清瘦素、胰岛素及SOCS3含量升高，与对照组比较有统计学意义，与相关报道一致［26，27］，验证了肥胖症存在胰岛素抵抗及瘦素抵抗。而经治疗后，特针组、非特针组大鼠体重与模型对照组对比显著下降，瘦素、胰岛素及SOCS3较模型对照组亦有显著下降;而特针组的胰岛素、SOCS3含量较非特针组下降更显著，该结果提示，针刺能减体重、降Lee’s指数，还能缓解胰岛素、瘦素抵抗，对肥胖症有治疗和预防作用;而SOCS3作为JAK/STAT通路的主要负性调节因子，与JAK2结合抑制其和瘦素受体的酪氨酸磷酸化，从而阻止了瘦素信号沿着 JAK/STAT通路的传导，经针刺后SOCS3含量减低，提示其可能参与调节JAK/STAT通路从而改善瘦素抵抗。

［1］ Mayor S．Simple formula can predict risk of childhood obesity at birth，study says［J］．BMJ，2012，345:e8166．

［2］ Ashwell M，Gibson S．Waist to height ratio is a simple and effective obesity screening tool for cardiovascular risk factors:Analysis of data from the British National Diet And Nutrition Survey of adults aged 19-64 years［J］．Obes Facts，2009，2(2):97 －103．

［3］ 吴 琼．肥胖并发症的临床流行病学调查分析［J］．湖南中医学院学报，2005，25(2):49 －50．

［4］ 杨建雄，王 健．中小学生肥胖流行病学调查－－以浙北地区为分析个案［J］．体育与科学，2005，26(3):63－65．

［5］ 李 珂，张 林，胡茂清．针刺治疗单纯性肥胖的中枢响应机制研究概况［J］．湖南中医杂志，2014，30(3):168－170．

［6］ 刘祖丽，唐成林．针刺治疗单纯性肥胖的研究进展［C］．重庆:重庆市针灸学会2010年学术年会，2010:12－19．

［7］ 刘祖丽，余 敏，唐成林．针刺治疗单纯性肥胖的研究进展［J］．中国民间疗法，2011，19(1):79 －80．

［8］ Schiza SE，Mermigkis C，Bouloukaki I．Leptin and leptin receptor gene polymorphisms and obstructive sleep apnea syndrome:is there an association?［J］．Sleep Breath，2015，19(3):1079 －1080．

［9］ Opland D，Sutton A，Woodworth H，et al．Loss of neurotensin receptor-1 disrupts the control of the mesolimbic dopamine system by leptin and promotes hedonic feeding and obesity［J］．Mol Metab，2013，2(4):423 －434．

［10］ Lv D，Tan L，Wu Y，et al．Leptin and leptin receptor gene polymorphisms in obstructive sleep apnea:a HuGE review and meta-analysis［J］．Sleep Breath，2015，19(3):1073 －1078．

［11］刘 芳，高南南，杨润梅，等．不同品系小鼠肥胖模型比较及C57BL/6J小鼠肥胖机制研究［J］．中国药理学通报，2013，29(3):360 －365．

［12］ Levin BE，Triscari J，Sullivan AC．Altered sympathetic activity during development of diet-induced obesity in rat［J］．Am J Physiol，1983，244(3):R347 － R355．

［13］ Levin BE，Dunn-Meynell AA，Balkan B，et al．Selective breeding for diet-induced obesity and resistance in Sprague-Dawley rats［J］．Am J Physiol，1997，273(2 Pt 2):R725 －R730．

［14］杨晓姣，洪 阁，刘天军．高脂饮食对营养性肥胖大鼠模型建立的影响［J］．武警后勤学院学报(医学版)，2014，23(2):121－123．

［15］ Siegrist-Kaiser CA，Pauli V，Juge-Aubry CE，et al．Direct effects of leptin on brown and white adipose tissue［J］．J Clin Invest，1997，100(11):2858 －2864．

［16］Björnholm M，Münzberg H，Leshan RL，et al．Mice lacking inhibitory leptin receptor signals are lean with normal endocrine function［J］．J Clin Invest，2007，117(5):1354 －1360．

［17］何仁胜，方春华，常 城，等．针刺对肥胖大鼠血中瘦素、神经肽Y表达的影响［J］．中国中医急症，2013，22(2):255－256．

［18］韩海荣，刘德全．针药并用对单纯性肥胖大鼠血清瘦素及下丘脑NPY基因表达的影响［J］．针灸临床杂志，2012，28(5):71 －73．

［19］ Wang ZW，Pan WT，Lee Y，et al．The role of leptin resistance in the lipid abnormalities of aging［J］．FASEB J，2001，15(1):108 －114．

［20］邢宏义，詹 浩，梅元武，等．老年肥胖高血压患者血清瘦素和胰岛素水平的研究［J］．中华老年心脑血管病杂志，2002，4(5):315．

［21］ Lebrun P，Cognard E，Gontard P，et al．The suppressor of cytokine signalling 2(SOCS2)is a key repressor of insulin secretion［J］．Diabetologia，2010，53(9):1935 －1946．

［22］龚美蓉，徐 斌，毛 珍，等．针刺对肥胖模型大鼠中胰岛素和胰岛素底物表达的影响［J］．时珍国医国药，2010，21(5):1243 －1245．

［23］李京真．针灸“关元”穴干预营养性肥胖大鼠脂联素的实验研究［D］．北京:北京中医药大学，2012．

［24］李红阳，唐红珍，庞 勇，等．特定穴位针刺的减肥效应研究［J］．时珍国医国药，2012，23(6):1466 －1467．

［25］李红阳．针刺按摩治疗单纯性肥胖症31例［J］．广西中医药，1996，19(5):35 －36．

［26］ Howard JK，Cave BJ，Oksanen LJ，et al．Enhanced leptin sensitivity and attenuation of diet-induced obesity in mice with haploinsufficiency of Socs3［J］．Nat Med，2004，10(7):734－738．

［27］ Jiang Y，Zhang Q，Soderland C，et al．TNFα and SOCS3 regulate IRS-1 to increase retinal endothelial cell apoptosis［J］．Cell Signal，2012，24(5):1086 －1092．