枯草芽孢杆菌对海南长臀鮠生长性能、血清生化指标和热休克蛋白HSP70的影响

吕子君 ， 李正光 ，2， 谢 骏 ， 谢少林 ， 王 超 ， 邹记兴 *

（1.华南农业大学动物科学学院，广东广州510642；2.清远市北江水产研究所，广东清远 511510；3.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，江苏无锡 214081）

长臀鮠（Cranoglanis bouderius）是鲇形目中名贵的养殖鱼类，属于长臀鮠科，长臀鮠属，享有“淡水之王”的美誉，具有重要的开发利用价值，已被列入中国濒危动物红皮书（黄卫盛等，2005）。海南长臀鮠（Cranoglanis bouderius multiradiatus）已被海南省列为二级保护动物。在人工养殖条件下，长臀鮠生长发育的适应性一直是难点问题，主要表现在养殖技术不规范，成活率低，饲料系数高，经济效益差。目前对长臀鮠的研究主要集中在其物种有效性、资源和激素调控方面的内容，关于长臀鮠血液生理生化和免疫方面的研究较少。因此，本试验研究了枯草芽孢杆菌对海南长臂鮠生长性能、血液生理生化指标及HSP70的影响。

1 材料与方法

1.1 试验饲料 参照黄颡鱼（DB35T 1054-2010）和长吻鮠（SC/T 1072-2006）的配合饲料标准，以进口鱼粉、次粉、豆粕、棉籽粕、α-淀粉等为原料，配制基础饲料。在基础饲料中分别加入0、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%（活菌数分别为 3×108、6×108、9×108、1.2×109cfu/g）的枯草芽孢杆菌。各种原料充分混匀后，再制成粒径为1.2 mm的颗粒饲料，50℃烘至水分大约为10%后密封冷藏保存。基础饲料组成及5组饲料主要营养水平见表1。

表1 基础饲料原料组成及营养水平 %

1.2 试验设计与饲养管理 枯草芽孢杆菌由中国水产科学研究院淡水渔业研究中心研制。长臀鮠鱼种由清远市兴渔水产有限公司提供。选择平均尾重为 （5.79±0.02）g的健康试验鱼驯养 7 d后，随机分为5组，每组3个重复，每个重复50尾鱼，以重复为单位分别放入15个循环流水的水族缸内，试验期为60 d。

长臀鮠投喂量占鱼体重的3%，每天投喂3次，在 8∶00、12∶00 和 16∶00 各投喂一次，每天早上进行吸污。整个试验期间平均水温（26.5±1.3）℃，溶氧≥6 mg/L，pH为6.8～7.7，氨氮≤0.04 mg/L，亚硝酸盐≤0.01 mg/L。

1.3 采样与测定方法 养殖试验结束后，停饲24 h，对各池鱼进行称重和计数，计算增重率（WGR）、肥满度 （CF）、特定生长率 （SGR）和饵料系数（FCR）。每个水族缸中随机抽取10尾长臀鮠采血、量体长等指标。鱼体釆血后于冰盘上解剖，每缸鱼取50 g左右的背肌用于肉质分析。取约0.1 g肝脏用液氮速冻后于-80℃保存用于热休克基因70（HSP70）含量测定。

1.3.1 血清生化指标测定 血样常温静置2 h后，4℃、10000 r/min离心5 min制备血清，-20℃冻存，用于测定血清生化指标。血清总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、碱性磷酸酶（AKP）、血糖（GLU）、甘油三酯 （TG）、 丙二醛 （MDA）、 过氧化氢酶（CAT）试剂盒，均购于南京建成生物工程研究所；总胆固醇（T-CHOL），均购于北京北化康泰临床试剂有限公司，测定方法按试剂盒使用说明操作。

1.3.2 生长性能指标测定 分别按下式计算增重率、特定生长率、饵料系数、肥满度：

增重率/%=（Wt-Wo）/Wo×100；

特定生长率/（%/d）=（Ln Wt-Ln Wo）/t×100；

饵料系数=FI/（Wt-Wo）；

肥满度/%=Wt/L3×100；

式中：Wo为试验初鱼体均重，g；Wt为试验末鱼体均重，g；t为饲喂天数，d；FI每尾鱼平均摄食总量（风干样重），g；L为试验末平均鱼体长，cm。

1.3.3 HSP70引物设计 应用Primer 5.0，根据NCBI上已有鲇形目HSP70序列 （斑点胡子鲶HM044876.1、胡子鲶LC013677.1、斑点叉尾鮰U22460.1）设计引物 PHSP70F、PHSP70R，扩增得到保守序列后设计荧光定量引物PHSP70RF、PHSP70RR，内参基因选择β-actin，根据已有鲇形目β-actin序列 （黄颡鱼 EU161065.2、克林雷氏KC195970.1、长吻鮠 JN833583.1、革胡子鲶KJ722166.1、胡子鲶 EU527190.2）设计长臀鮠内参定量引物 Pβ-actinRF、Pβ-actinRR，所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，扩增的序列片段的大小为100～150 bp。引物具体见表2。

表2 基因表达的引物

1.3.4 SYBR荧光定量RT-PCR的步骤 每0.05 g肝脏组织加入1mL Trizol，提取总RNA后反转录cDNA，参照慈丽宁（2011）的方法。本试验采用相对定量的方法，以对照组为基准，选择p-actin为内标，以校正所加的cDNA量。扩增反应釆用了SYBR GreenⅡ嵌合突光法，cDNA稀释20倍，反应程序为：（1）95 ℃、30 s；（2）95℃、5 s；（3）60 ℃、30 s；（4）95 ℃、15 s；（5）60 ℃、1min；（6）95 °C、15 s。

其中第二到第三步共进行40个循环，四五步制作溶解曲线。

反应体系为 20 μL，其中 SYBR GreenⅡ 10 μL、PrimerF 0.8 μL、PrimerR 0.8 μL、Rox Dye 0.4 μL、H2O 4 μL、cDNA 4 μL。

1.4 数据处理 采用SPSS 16.0统计软件中one-way ANOVA分析数据，选用Duncan’s法进行多重比较，试验结果以“平均数±标准差”表示（置信区间为0.95）。荧光定量PCR检测结果导出后，采用用 2-△△Ct法，用 SPSS 16.0 来计算 HSP 70的表达量。

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌对长臀鮠生长性能的影响由表3可知，添加枯草芽孢杆菌对长臀鮠的存活率无显著影响（P＞0.05）。当枯草芽孢杆菌的添加量超过0.6%时，终末体重显著提高，其中0.9%组和1.2%组分别比对照组提高了21.97%和23.14%（P＜0.05）。增重率和特定生长率也以0.9%组、1.2%组最高，分别较对照组提高36.62%、39.24%（P ＜ 0.05）和 20.92%、22.88%（P ＜ 0.05）。随着枯草芽孢杆菌添加水平的提高，各组的饵料系数分别比对照组下降了 16.67%（P＞0.05）、16.67%（P ＞ 0.05）、23.91%（P ＜ 0.05）、26.81%（P ＜ 0.05），肥满度则出现先上升后下降的趋势，但各试验组与对照组差异均不显著（P＞0.05）。

表3 枯草芽孢杆菌对长臀鮠生长性能的影响

2.2 枯草芽孢杆菌对长臀鮠血清生化指标的影响 由表4可知，本试验是否添加枯草芽孢杆菌对长臀鮠血清葡萄糖的影响不显著 （P＞0.05）。各试验组血清总蛋白比对照组分别显著提高了7.90%、7.61%、4.83%和 12.69%（P＜0.05）。 添加芽孢杆菌对白蛋白有提高的作用，其中以0.3%组和0.6%组最高（P＜0.05）。碱性磷酸酶有提高的趋势，但组间差异不显著（P＞0.05）。1.2%组甘油三酯和总胆固醇均显著降低（P＜0.05），但0.3%组的甘油三酯含量更低 （P＜0.05）。试验组丙二醛含量与对照组差异不显著（P＜0.05），血清过氧化氢含量以0.9%组的活性最高，比对照组提高了41.89%（P ＜ 0.05）。

表4 枯草芽孢杆菌对长臀鮠血清生化指标的影响

2.3 枯草芽孢杆菌对长臀鮠HSP70表达量的影响 由图1可知，在本研究的添加量范围内，枯草芽孢杆菌的添加量越大，对HSP70表达量的影响越大。各组长臀鮠检出的HSP70表达量分别为1.09、1.21、1.43、1.53、2.41， 试验组比对照组分别提 高 了 11.01% （P ＞ 0.05）、31.19% （P ＜ 0.05）、40.37%（P ＜ 0.05）和 121.10%（P ＜ 0.05）。

3 讨论

研究表明，枯草芽孢杆菌能降低中华绒螯蟹饵料系数，提高增重率，增强免疫力和抗病力（陈文典等，2009）。沈斌乾等（2013）研究表明，是否添加枯草芽孢杆菌对青鱼的存活率影响不显著。胡凡光等（2014）和沈文英等（2011）对草鱼分别添加1‰、2‰枯草芽孢杆菌的研究结果显示，增重率和特定生长率比对照组有显著提高。胡凡光等（2014）在大菱鲆饲料中添加5‰的芽孢杆菌饲养40 d，显著降低了饲料系数。本试验在0.9%和1.2%添加量时，对长臀鮠的研究与上述结果相似。但有研究表明，在网箱养殖鲤时添加2‰的芽孢杆，对增重率和饵料利用率有所下降（江萍等，1997）。

一般情况下，鱼类的血液指标是相对稳定的，并且可以反映鱼体生理和营养状况 （林浩然，1999）。血脂水平可反映全身脂类物质的代谢状况（Hiraoka等，1979）。已有研究表明，芽孢杆菌具有缓解脂质过氧化的作用，还能清除机体羟自由基及提高CAT活性 （程远等，2014；沈文英等，2009）。血浆中的AKP与脂肪、糖类和蛋白质的吸收与运输关系密切（洪宁等，2007）。CAT可以分解氢氧自由基和过氧化氢，在调节细胞免于活性氧的氧化损伤过程中起着重要的作用（瞿建宏等，2006；鲁双庆等，2002）。MDA能一定程度上反映脂质的过氧化程度和细胞损伤程度，在血清中的含量往往与SOD活性相对立。本试验结果显示，饲料中添加芽孢杆菌能提高TP、ALB和CAT水平，维持血糖水平，降低TG、T-CHOL水平。在本试验的添加范围内，AKP有一定的提高，MDA有下降的趋势，但与对照组相比差异不显著，这与沈文英（2011）对草鱼研究的结果有所不同。这可能与添加的菌株、添加量、养殖对象和养殖周期有关。

热休克蛋白（HSPs），又称热应激蛋白，是机体抗逆能力的表现（Basu等，2002）。HSP70s是其中最保守和最重要的一族，主要与抗应激、提高细胞生存能力和提高对环境的耐受性有关（Ming等，2012）。利用添加剂来调控机体HSP70水平来实现提高抗应激能力已成为研究热点。有研究表明HSP70可通过反馈抑制作用减少氧自由基的产生，提高内源性过氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）水平，从而加快氧自由基的清除（张红波等，2009）。研究发现，大黄等中草药能提高水生动物HSP70的合成（崔素丽等，2013；雷爱莹和曾地刚，2008）。本研究结果说明枯草芽孢杆菌对长臀鮠HSP70的合成起促进作用。

4 结论

本研究结果表明，枯草芽孢杆菌可提高长臀鮠增重率和特定生长率，降低饵料系数，提高血液蛋白水平，降血脂，增强抗应激能力。枯草芽孢杆菌作为饲料添加剂对水生动物的作用效果已逐渐被证实。目前对枯草芽孢杆菌的研究主要是围绕生长性能、免疫、消化酶和抗氧化能力开展的，对于抗应激方面的研究甚少。如果能结合热休克蛋白和其他性能进行研究，则会进一步揭示枯草芽孢杆菌的作用机理，从而大大推进枯草芽孢杆菌在水产上的应用。本研究建议枯草芽孢杆菌添加量为0.9%～1.2%。

[1]陈文典，李义，郝向举，等.枯草芽孢杆菌微胶囊制剂对中华绒螯蟹免疫机能及抗病力的影响[J].中国饲料，2009，5：33 ～ 36.

[2]程远，黄凯，黄秀芸，等.饲料中添加枯草芽孢杆菌对吉富罗非鱼生长性能、免疫力和抗氧化功能的影响[J].动物营养学报，2014，26（6）：1 ～ 10.

[3]慈丽宁.藻粉替代鱼粉对团头魴生长性能、营养成分、消化机能和免疫的影响：[硕士学位论文][D].南京：南京农业大学，2011.

[4]崔素丽，刘波，徐跑，等.两种温度下大黄素对团头鲂生长、血液指标及肝脏 HSP70 mRNA 表达的影响.[J]水生生物学报，2013，37（5）：919 ～ 928.

[5]洪宁，胡信雷，耿春辉.活血通络中药复方对家兔骨折后血清碱性磷酸酶、钙、磷的影响[J].淮海医药，2007，25（5）：420 ～ 424.

[6]胡凡光，郭萍萍，麻丹萍，等.饲料中添加枯草芽孢杆菌对促进大菱鲆生长及养殖水环境的影响[J].渔业现代化，2014，41（2）：7 ～ 11.

[7]黄卫盛，谢俊刚，苏怡林，等.珠江长臀鮠的生物学特性研究[J].水产科技，2005，3：36 ～ 37.

[8]江萍，夏先林，周碧君，等.两种微生态调节剂对网箱鲤 鱼 生 产 效 果的 影 响 [J].中国微生态学杂志，1997，9（3）：26 ～ 28.

[9]瞿建宏，陈家长，胡庚东，等.苯酚胁迫下罗非鱼组织中过氧化氢酶与谷胱甘肽-S-转移酶的动态变化[J].生态环境 2006，15（4）：687 ～ 692.

[10]雷爱莹，曾地刚.复方中草药对凡纳滨对虾热应激蛋白70基因表达的影响[J].广西农业科学，2008，9（6）：830 ～ 833.

[11]林浩然.鱼类生理学[M].广州：广东高等教育出版社，1999.185～188.

[12]鲁双庆，刘少军，刘红玉.Cu2+对黄鳝肝脏保护酶 SOD、CAT、GSH-PX活性的影响[J].中国水产科学，2002，2：l38 ～ 141.

[13]沈斌乾，陈建明，郭建林，等.饲料中添加枯草芽孢杆菌对青鱼生长消化酶活性和鱼体组成的影响[J].水生生物学报，2013，37（1）：48 ～ 53.

[14]沈文英，李卫芬，梁权，等.饲料中添加枯草芽孢杆菌对草鱼生长性能免疫和抗氧化功能的影响[J].动物营养学报.2011，23（5）：881 ～ 886.

[15]沈文英，余东游，李卫芬，等.地衣芽孢杆菌对三角帆蚌消化酶活性、免疫指标和抗氧化指标的影响[J].动物营养学报，2009，21（1）：95 ～ 100.

[16]张红波，万亚涛，王莲哲，等.在细胞应激反应中HSP70的保护与调节作用[J].中国实用医药，2009，14（4）：228 ～ 229.

[17]Basu N，Todgham A E，Ackerman P A，et al.Heat shock protein genes and their functional significance in fish[J].Gene，2002，295（2）：173 ～ 183.

[18]DB35/T 1054-2010黄颡鱼配合饲料[S].

[19]Hiraoka Y，Nakagawa H，Murachi S，et al.Blood properties of rainbow trout in acute hepatotoxity （sic）by carbon tetrachloride[J].Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries，1979，45（4）：527 ～ 532.

[20]Ming J H，Xie J，Xu P，et al.Effects of emodin and vitamin C on growth performance，biochemical parameters and two HSP70s mRNA expression of Wuchang bream （Megalobrama amblycephala Yih）under high temperature stress[J].Fish&Shellfish Immunology，2012，32（5）：651 ～ 661.

[21]SC/T 1072-2006长吻鮠配合饲料[S].