缺血后处理对局灶脑缺血再灌注大鼠Toll样受体2表达的影响

邢变枝 陈 晖 汪华新



缺血后处理对局灶脑缺血再灌注大鼠Toll样受体2表达的影响

邢变枝 陈 晖 汪华新

【摘要】目的 探讨缺血后处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注时Toll样受体2（TLR2）表达的影响。方法 成年雄性SD大鼠90只，分为假手术组、缺血再灌注组、缺血后处理组各30只；用线栓法建立局灶性大脑中动脉闭塞模型（MCAO），随机分为假手术组（sham）、缺血再灌注组（I／R）、缺血后处理组（IPC），分别于再灌注24、48、72h后留取大脑皮质组织；采用Longa的等级评分法进行神经行为学评分，免疫组化和蛋白质印记（Western blot）法检测TLR2蛋白的表达水平，逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）检测TLR2mRNA表达水平。结果 （1）缺血后处理组大鼠神经行为学评分明显改善；（2）缺血再灌注组TLR2蛋白在再灌注24、48、72h表达水平明显升高（P＜0．05）；缺血后处理组TLR2蛋白表达在各时间点均减少（P＜0．05）；TLR2 mRNA的表达趋势与蛋白表达基本一致。结论 缺血后处理可以降低TLR2表达水平，这可能是其脑保护作用的部分机制之一。

【关键词】脑缺血 缺血后处理 缺血再灌注损伤 Toll样受体2

【DOI】 10．3969／j．issn．1007－0478．2015．05．005

随着人口老龄化及生活方式的改变，缺血性脑卒中已成为致命、致残及严重影响生活质量的主要疾病之一。在缺血性脑卒中的治疗中无论是溶栓还是动脉介入治疗，目的都是使闭塞的脑动脉再通，恢复梗死区的血液供应，而再灌注过程往往加重组织

细胞功能代谢障碍及结构破坏，即再灌注损伤，因此寻找有效的细胞保护方法是临床上急待解决的问题。在过去几十年中尽管人们在这方面做了大量的努力，但是很少有神经保护剂能真正地从试验研究应用到临床治疗。缺血后处理（ischemic postconditioning，IPC）是指在脑缺血发生后长时间的再灌注之前对脏器进行数次短暂的再灌注／缺血循环的处理方法。目前已证实脑缺血后处理能有效减轻缺血再灌注损伤（ischemia－reperfusion injury，I／R），而其具体保护作用机制至今尚未完全阐明。

TLRs是一类跨膜信号传递受体蛋白，其中Toll样受体2（TLR2）不仅启动炎症反应，还与缺血后脑损伤的发生、发展及预后关系密切［1－2］。本研究采用雄性SD大鼠制作局灶性脑缺血再灌注模型，观察缺血后处理对脑缺血再灌注损伤后皮质内TLR2表达水平的影响，以探讨脑缺血后处理可能的作用机制。

1 材料与方法

1．1 实验动物

健康成年SD雄性大鼠90只，体重250～280g，购自武汉大学实验动物中心，在无特定病原体屏障环境下饲养，并由该中心检测动物健康指标。

1．2 主要试剂

兔抗TLR2单克隆抗体、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗兔IgG二抗（美国Cell signaling公司）、氯化三苯四氮唑（TTC）（武汉博士德生物工程有限公司）、Trlzol试剂（Glbco BRL公司）、焦炭酸二乙酯（Sigma公司）、溴化乙锭（Sigma公司）、MCAO栓线（北京沙东生物技术有限公司）。

1．3 方法

1．3．1 动物模型与分组

SD大鼠随机分为假手术（sham）组、缺血再灌注（I／R）组、缺血后处理（IPC）组，每组各30只。大鼠均采用Koizumi等线栓法经右侧颈外一颈内动脉插线建立右侧大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）再灌注模型［3］；栓线采用4－0尼龙单线，以10%水合氯醛（300mg／kg）腹腔注射麻醉，仰卧固定，分离并暴露右侧颈总动脉（common carotid artery，CCA）、颈内动脉（internal carotid artery，ICA）和颈外动脉（external carotid artery，ECA），结扎并切断ECA及其分支，沿根部结扎ICA颅外分支翼腭动脉；由ECA残端插入一根尼龙单线，沿ECA、CCA分叉部和ICA轻轻推进，至ICA颅内分叉处时可阻断流入MCA的血流，进线长度18～20mm；缺血时间为60min，随后抽出插线使血流恢复实现再灌注。假手术组除不插线外，余步骤同上。缺血后处理组在MCAO 60min后将尼龙线拔出5mm，再灌30s后再将尼龙线放入初始位置，缺血30s，反复6次［4－5］；分别于再灌注24、48、72h后处死各组大鼠，每个时间点各10只大鼠。

1．3．2 神经行为学评分

按Longa的等级评分法进行神经功能评分。0分：无明显神经缺损症状；1分：不能伸展对侧前肢；2分：行走时向对侧旋转；3分：行走时向对侧倾倒；4分：不能自行行走伴意识丧失。

1．3．3 脑组织含水量测定

脑缺血再灌注24h后大鼠断头取脑，取左侧大脑后1／4组织称取湿重后放入恒温电热烤箱中，105℃烤至恒重后再称干重，按公式计算：脑组织含水量＝（湿重－干重）／湿重×100%。

1．3．4 免疫组化检测TLR2的表达水平

将石蜡切片再以新鲜配制的体积分数为3%的H2O2灭活细胞内源性过氧化物酶，然后用血清封闭，根据测试指标分别滴加抗TLR2单克隆抗体以及相应生物素化二抗，DAB显色，封片。

1．3．5 蛋白质印记（Western blot）法检测TLR2蛋白表达水平

取大鼠脑组织匀浆后用RIPA组织细胞裂解液裂解，提取细胞总蛋白；利用SDS－聚丙烯酰胺凝胶（SDS－PAGE）进行蛋白质分离，电转至NC膜，用5%脱脂奶粉封闭1h后用TBS洗膜；在封闭液中按1：1000加入一抗即兔抗小鼠TLR2单克隆抗体（参照物为β－actin），缓慢摇动4℃过夜，弃去一抗，TBS洗膜，加羊抗兔IgG二抗，缓慢摇动1h，TBS洗膜；化学发光法曝光，显影定影，拍照观察胶片上的条带，并采用Quantity One软件进行分析。

1．3．6 逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）检测TLR2mRNA表达水平

采用Trizol一步法提取细胞总RNA，逆转录成cDNA；大鼠TLR2正义和反义引物分别为5’－GGAAGCAGGTGACAACCATT－3’，5’－AATCCTGCTCGCTCGCTGTAGGAA－3’，扩增产物为317bp；以β－actin mRNA为内参照，其正义和反义引物为5’－GGCATCCTGACCCTGAAGTA－3’，5’－AGGAAGGAAGGCTGGAAGAC－3’，其产物为614bp；PCR条件为94℃预变性5min，94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸90s，扩增35个循环；取5uL产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶图像分析系统进行半定量分析，数据以目的β－actin比值表示。

1．3．7 统计学处理

数据以均数±标准差（珚x±s）表示，采用SPSS 13．0统计软件。多个样本均数比较采用单因素方差分析，P＜0．05为差异具有显著性。

2 结 果

2．1 各组神经行为学评分（NDS）

I／R组和IPC组均表现为典型的大脑中动脉供血区梗死症状如同侧霍纳征和对侧肢体不同程度的神经功能缺损，如不能伸展患肢、行走时向左侧转圈，个别出现向左侧倾倒，但IPC组较I／R组评分明显改善（P＜0．05）（表1）。

2．2 脑组织含水量

I／R组脑组织含水量增高，其与sham组比较有显著性差异（P＜0．05），但IPC组较I／R组脑组织含水量显著降低（P＜0．05）（表1）。

表1　各组再灌注24hNDS和脑组织含水量（珚x±s）

2．3 各组再灌注24hTLR2免疫组化染色

sham组脑皮质组织内TLR2阳性神经细胞散在于大脑皮层，数量较少（图1）。I／R组和IPC组缺血区脑皮质组织TLR2阳性表达神经细胞较多，但缺血中心区及对侧半球内表达不明显或不表达。IPC组缺血区脑皮质组织神经细胞TLR2表达水平显著低于I／R组（图1）。

2．4 各组TLR2蛋白表达水平比较

sham组有少量TLR2表达，缺血再灌注损伤24h后缺血再灌注区皮质内TLR2合成明显增加，在48h达到高峰。在24和48h时间点IPC组缺血再灌注区皮质内TLR2的表达较I／R组减少（P＜0．05）（图2）。β－actin作为胞浆成分加等量蛋白的质控。

图1　各组TLR2免疫组化（400×倍）

图2　Western blot检测TLR2蛋白表达水平变化

2．5 各组TLR2mRNA表达水平比较

TLR2mRNA表达水平在24h明显升高，I／R组和IPC组TLR2mRNA表达水平在24、48h组明显升高，2组有明显差异（P＜0．05），IPC72h亚组mRNA的表达水平与假手术组比较无明显差异（图3）。

RT－PCR检测显示sham组有少量TLR2mRNA表达。缺血再灌注损伤24h后缺血再灌注区大脑皮质内TLR2mRNA表达增强（P＜0．05），然后逐渐减弱，IPC组在各时间点TLR2mRNA表达明显减弱，显著低于I／R组（P＜0．05）（图3）。

图3　RT－PCR检测TLR2mRNA的表达水平变化

3 讨 论

近年来随着临床溶栓、介入等治疗方法的广泛应用，脑再灌注损伤愈来愈引起脑血管病专科医生的重视。缺血后处理发生在缺血事件后具有可控性，因此具有较大的临床价值。缺血后处理对脏器的保护作用最早发现在心脏。近年来国内外学者报道缺血后处理可以减轻大鼠的脑缺血再灌注损伤［6－7］，这与我们先前的研究结果一致［4－5］，但是这一现象的机制目前仍然不清楚。

Toll样受体是一类跨膜受体，能识别外源性微生物或内源性配体，启动天然免疫和炎症反应，其在无明显外源性微生物感染的I／R中起十分重要的作用［1－2］。已发现Toll样受体共有13种，它们表达在多种细胞膜表面，其中TLR2广泛表达于小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞和血管内皮细胞［8－10］。TLR2通过炎症因子TN F－α、IL－1b及NF－κB、高迁移率族蛋白B1等加重组织损伤［11］；还可以通过髓样分化蛋白88（M yD88）、Caspase 8等凋亡途径进一步加重组织损伤。Seija Lehnardt等证实在小鼠局灶性缺血脑组织的小胶质细胞中有TLR2蛋白的表达，并且相对TLR2缺陷型小鼠，野生型小鼠的局灶性缺血脑组织中其TLR2mRNA表达上调［12］。Ziegler等对短暂局灶性脑缺血再灌注损伤小鼠2d后缺血区域神经元死亡及CD11b阳性炎性细胞进行了研究，证实TLR2缺陷型小鼠相对C57BI／6野生型小鼠显著减少缺血区域的神经元死亡和CD11b阳性细胞数目［13］。大量研究已证实缺血后处理对各个脏器的保护机制与抑制细胞凋亡、减少氧自由基、抑制炎症等有关，然而TLR2是否参与了缺血后处理对局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用，还尚不明确。本研究建立在我们研究小组成熟的线栓法局灶脑缺血再灌注模型中对这一问题进行探讨。

本实验结果表明，在局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠模型中术后神经功能学证实IPC能对局灶脑缺血再灌注损伤产生保护作用。在再灌注24、48、72hTLR2蛋白表达均明显增加，提示I／R刺激TLR2表达增加，而与I／R组比较，IPC组TLR2蛋白表达增加程度降低。因此，本研究提示缺血后处理的保护机制之一可能是通过多次循环复灌复停减少了突然再灌注从而抑制TLR2mRNA的转录和TLR2蛋白的翻译，进而减弱炎症反应，抑制神经细胞凋亡等途径而发挥神经元保护作用。由于缺血后处理可在脏器缺血后应用，所以具有较大得临床应用价值。但是缺血后处理究竟通过什么分子途径调控TLR2的表达和合成，尚有待进一步深入研究。对于脑缺血后处理的分子机制及如何启动脑缺血时机体的内源性神经保护作用的研究，对于寻找脑缺血保护的有效治疗途径及防治脑梗死后再灌注损伤具有积极意义。

参考文献

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（2015－03－24收稿）

作者单位：430060 武汉大学人民医院放射科（邢变枝），泌尿外科（陈 晖），麻醉科（汪华新）

Effects of ischemic postconditioning on TLR2 expression in rats cerebral with ischemia／reperfusion injuryXing Bianzhi，Chen Hui，Wang Huaxin．Department of Radiology，Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060

【Abstract】Objective To investigate the protective effect of ischemic postconditioning by examining the express of toll－like receptor 2（TLR2）in cerebral ischemic reperfusion injury（I／R）．Methods SD rats model of focal ischemic reperfusion was induced by intraluminal middle cerebral artery occlusion（MCAO）with a nylon monofilament suture．Ischemic animals were randomly assigned to 3groups：sham group（n＝30），I／R group （n＝30）and IPC group（n＝30）．Each group was divided into 3subgroups by the different times after reperfusion（t＝24h，t＝48h，t＝72h）．In IPC group，animals were further subjected to postconditioning（3cycles of 30sischemia and 30sreperfusion）after MCAO．Neurologic scores and infarct volumes were assessed at 24，48and 72hours．TLR2was examined by immunohistochemistry，Western blot and RT－PCR．Results IPC treatment improved neurologic scores and reduced infarct volumes compared with the I／R group．Compared with the sham group，the expression of TLR2increased in the rats undergoing I／R procedure．The level of TLR2significantly reduced in ischemic postconditioning group．Conclusions Ischemic postconditioning can reduce the expression of TLR2which may be related to neuroprotective effects．

【Key words】Brain ischemia Ischemic postconditioning Ischemic／reperfusion TLR2

基金项目：国家自然科学青年基金（30901552）

【文章编号】1007－0478（2015）05－0273－04

【文献标识码】A

【中图分类号】R743