高效液相色谱法测定东洞庭湖区野生水芹茎叶中氨基酸

易雪静，周石柔，邓兰青，徐中海

(1.岳阳职业技术学院 医学基础部，湖南 岳阳 414000;2.岳阳市洞庭湖区特色中药材综合利用重点实验室，湖南 岳阳 414000)

水芹(Oenanthe javanica )系伞形科多年生草本植物，一般生于低湿洼地、浅水沼泽、河流岸边。全国大部分省份均有分布，洞庭湖区野生水芹资源尤为丰富。水芹很少或不受病虫危害，无需施用农药、化肥，其茎、叶均可食用，品质鲜嫩爽口，风味独特，食疗俱佳，是很有前途的药用植物和保健蔬菜。水芹全草入药，气味甘、平，有清热解毒、利尿、止血和降压功效。主治感冒发烧、暴热烦渴、呕吐腹泻、黄疸、水肿、尿路感染、淋病、白带、崩漏、瘰疬和腮腺炎等症［1］。近年来研究发现水芹具有抗氧化、抗乙肝病毒、降压降脂、抗过敏、抗凝血等多种功效［2-3］。水芹化学成分仅有挥发油［4-5］、黄酮［6］、维生素E［7］的研究报道，未见其氨基酸成分的研究文献。

氨基酸是组成蛋白质的基本单元，是人体必需的营养成分，具有非常重要的生理功能。随着在食品、化学和临床医学等领域的研究逐渐深入，氨基酸分析显得越来越重要。目前对氨基酸分析常采用的检测方法有离子交换色谱、气相色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法等，检测方法也包括紫外可见光谱吸收法、荧光法、化学发光法等。与其它分析方法相比，HPLC 柱前衍生荧光分析法具有分析操作简单、分离度好和重现性好等优点，近年来已广泛应用于氨基酸的分析测定。且邻苯二甲醛本身不发荧光，色谱分离中不会形成干扰峰，检测灵敏度高。

本文采用邻苯二甲醛作为柱前衍生化试剂，结合反相高效液相色谱技术，对东洞庭湖区野生水芹茎、叶中15 种常见氨基酸进行了定性和定量分析，取得了较好的效果。为进一步研究水芹的药用价值，探讨水芹中氨基酸与其它成分的相互作用提供了一定的依据。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

水芹采自东洞庭湖区芭蕉湖畔，60 ℃烘干后备用;氨基酸(SIGMA)、甲醇(液相色谱用)、无水乙醇、四氢呋喃、醋酸、无水醋酸钠、硼酸、邻苯二甲醛(SIGMA)均为分析纯;所用水均为二次重蒸馏水。

Shimadzu LC-6A :SCL-6A SYSTEM CONTROL;Shimadzu LC-6A pump;Detector RF-530 Fllourence HPLC;TGL-1 离心机。

1.2 溶液配制

1.2.1 标准溶液 准确称取天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、组氨酸(His)、丝氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、苏氨酸(Thr)、精氨酸(Arg)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、蛋氨酸(Met)、缬氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)各适量，用0.1 mol/L HCl 配制成0.5 mmol/L溶液，置于4 ℃避光保存。乙酸钠溶液配制:4.04 g无水乙酸钠，溶于1 000 mL 水中，0. 25 μm 滤膜过滤。

1.2. 2 衍生化试剂 10 mg 邻苯二甲醛，加入0.6 mL醇，2.4 mL 2%硼酸，30 μL 巯基乙醇。

1.2.3 流动相 A 液:100 mL 甲醇加入900 mL 乙酸钠溶液以及10 mL 四氢呋喃，超声脱气。B 液:800 mL 甲醇加入200 mL 乙酸钠溶液以及10 mL 四氢呋喃，超声脱气。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件 色谱柱:依利特Hypersil ODS(25 μm，4.6 mm ×150 mm)，柱温35 ℃，流动相0 ～4 min:A 液100%，4 ～5 min:A 液100% ～79%，B 液0 ～21%，5 ～20 min:A 液79% ～77%，B液21% ～23%;20 ～21 min:A 液77% ～0，B 液23% ～100%;26 ～27 min:A 液0 ～100%，B 液100% ～0。流速1 mL/min，检测波长荧光检测器EM:430 nm，EX:338 nm。

1.3.2 样品处理 精密称取水芹茎、叶各1 g 左右，分别置于20 mL 安培瓶中，分别加入6 mol/L HCl 10 mL，封口后于110 ℃水解12 h，冷却后过滤，分别取0.2 mL 于60 ℃水浴吹干，加入A 液1.0 mL溶解并转入1.5 mL 离心管中，于12 000 r/min 离心3 min，4 ℃避光保存，备测。

1.3.3 样品的测定 取5 μL 样品于1.5 mL 离心管中，加入50 μL 衍生试剂，涡旋振荡1 min。取20 μL注入色谱仪。以峰面积工作曲线定量，以保留时间定性。

2 结果与讨论

2.1 样品中氨基酸分析与含量测定

水芹叶样品中氨基酸分析的高效液相色谱图见图1。

图1 水芹叶氨基酸高效液相色谱图Fig.1 High-performance liquid chromatogram of amino acids in leaves of oenanthe javanica

由图1 可知，水芹茎样品的色谱图与水芹叶样品类似，只是氨基酸的含量有所差异。水芹茎和叶中各种氨基酸的含量测定结果见表1。

表1 水芹茎叶中氨基酸的种类和含量Table 1 The content of amino acids in stems of oenanthe javanica

由表1 可知，水芹叶及茎中氨基酸含量丰富，总量分别达到6.939 g/100 g 和1.882 g/100 g。其中以天冬氨酸、谷氨酸含量最高，在叶中占氨基酸总量的14%和15%，在茎中占到35%和19.9%，蛋氨酸含量最低。叶及茎中必需氨基酸含量分别为2.858 g/100 g和0.483 g/100 g，必需氨基酸占氨基酸总量的41.19%和25.67%。

2.2 讨论

本研究采用常用的柱前衍生法、荧光检测器，能测定出水芹茎、叶中15 种常见氨基酸成分的含量，且柱效和分离度均很满意，其精密度和准确度可以满足定性和定量的要求。

野生水芹中氨基酸的含量分析，目前国内未见报道。本文利用反相高效液相色谱法对东洞庭湖区野生水芹茎叶中的氨基酸进行了分析研究。结果表明，水芹茎及叶中氨基酸含量丰富，且叶中含量要高于茎中含量，也提示人们在食用水芹时更要注意叶的食用。水芹叶中必需氨基酸在总氨基酸中占到41. 19%，达到了WHO/FAO 提出的理想蛋白质EAA/TAA 为40%的要求［8］，是开发食品的理想原料。根据文献比较［9-10］，水芹叶中氨基酸总量及必需氨基酸所占比例均高于经常食用的香菇、结球甘蓝、仙人掌、生菜、黄瓜等常见蔬菜。其中含量最高的天冬氨酸和谷氨酸是呈鲜味的氨基酸，是决定水芹口味口感的内在因素。且天冬氨酸在中枢神经系统和脊索某些部位有兴奋神经递质作用，临床广泛用于治疗肝炎、肝硬化、肝昏迷［11］;谷氨酸具有红细胞生成、改善脑细胞营养及活跃思想的作用，是治疗神经衰弱和记忆力减退的有效成分［12］。因此，水芹中高含量的天冬氨酸和谷氨酸可能是其具有保健功能的重要物质基础。

3 结论

本研究对水芹茎及叶中氨基酸的组成及含量进行了分析，共分离测定了15 种氨基酸。水芹茎及叶中氨基酸含量丰富，必需氨基酸在总氨基酸中占很大比例。氨基酸在人体的需要量虽然不大，但却有极其重要的生理功能，因此水芹可用于食品、医药等领域，具有很好的应用和开发前景。

研究中采用高效液相色谱-柱前衍生荧光分析法测定氨基酸的含量，分离方法简便，易于操作，结果可靠。该分析方法可为其他植物中氨基酸成分的分析提供参考。

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