葛根中黄酮的提取与纯化研究

李扬，李梦耀，袁胜，周旸

(1.长安大学 环境科学与工程学院，陕西 西安 710054;2.长安大学 陕西省地下水与生态环境工程研究中心，陕西 西安 710054)

黄酮类化合物是一组存在于植物中的天然产物，葛根为豆科植物野葛的根，葛根的主要活性成分是大豆黄酮苷元、大豆苷、葛根素等多种异黄酮类物质，具有抗菌、活血化瘀、扩张冠状动脉血管和脑血管、降低心肌耗氧量、改善心肌收缩功能、促进血液循环、增强机体免疫力等多种药理与保健作用［1-2］。葛根总黄酮作为许多药物与保健品的主要功能成分具有重要的价值，其提取与功能应用的研究是目前的热点之一［3-5］。为了更好地开发和利用葛根，本文就葛根总黄酮的提取与纯化工艺研究进行探究，以期为进一步提高葛根资源的开发利用价值提供科学依据。本文采用传统的有机溶剂提取法，以葛根作为提取原料，乙醇作为提取溶剂提取葛根中的黄酮。并利用LS-303 型树脂进行进一步地分离纯化，研究葛根黄酮在其上的吸附性能，通过不同条件下的静态实验、动态实验，对于优化生产工艺、提高分离效果，充分利用天然产品资源具有重要意义，尤其是为推广大孔吸附树脂纯化法应用于中药制剂提供应用基础。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

葛根粉，购于陕西西安市药房，购回后放入干燥处贮存;95%乙醇、无水乙醇、黄酮(芸香叶苷)均为分析纯;LS-303 树脂，工业品。

752 型紫外可见分光光度计;WFZ-26A 紫外可见分光光度计;AL204 电子天平;DK-98-1 型单列八孔水浴锅;DK-98-1 型电热恒温水浴锅;HY-2 调速多用振荡器;320 pH 计;101-2AB 型电热鼓风干燥箱。

1.2 黄酮的分析方法

黄酮的测定方法选用紫外分光光度法，测定最大吸收波长分别为255 nm 和350 nm。在一定浓度范围内，吸光度与黄酮的浓度呈线性关系，其线性回归方程分别为:A255=0. 029 2 c +0. 005 6，A350=0.022 0c+0.003 4。

1.3 实验方法

1.3.1 葛根中黄酮的提取 有机溶剂提取法，以葛根粉为原料，乙醇为提取溶剂。称取一定量的葛根粉，加入适量的乙醇，在一定温度下，静置一段时间后取出，用微孔滤膜进行过滤，得到提取液。在提取过程中，采取单因素变量方法，针对提取时间、乙醇体积分数、料液比、温度4 个变量逐一进行单因素变量实验，确定最佳提取条件。计算葛根黄酮的提取率。

式中 R——葛根黄酮提取率，mg/g;

m1——样品溶液中黄酮的质量，mg;

m2——葛根粉质量，g。

1.3.2 葛根中黄酮的纯化 称取适量处理好的树脂，用湿法装柱法进行装柱，柱高7.5 cm。取一定量的葛根黄酮提取液，以一定流速通过柱子，检测流出液中黄酮的浓度，即可计算出大孔树脂对葛根黄酮的动态吸附量及吸附率。当达到吸附平衡后，再用60%乙醇进行解吸，以一定流速通过柱子，检测解吸液中黄酮的浓度，即可计算出大孔树脂对葛根黄酮的解吸率。分别计算葛根黄酮的吸附率、解吸率以及动态吸附量。

式中 R吸——葛根黄酮的动态吸附率，%;

c0——黄酮提取液的初始浓度，μg/mL;

ce——黄酮提取液的平衡浓度，μg/mL。

式中 R解——葛根黄酮的动态解吸率，%;

c解——解吸液中黄酮的浓度，μg/mL。

式中 Qe——葛根黄酮的吸附量，μg/g;

V——黄酮提取液的体积，mL;

w——树脂的质量，g。

2 结果与讨论

2.1 葛根中黄酮的提取

2.1.1 提取时间对提取率的影响 根据葛根中黄酮的提取方法，准确称取3.0 g 研磨好的葛根粉，分别加入料液比为1∶16.7 g/mL，浓度为40%的乙醇溶液50 mL，60 ℃的条件下，分别提取0.5，1，1.5，2，2.5，3 h，对不同提取时间提取液中黄酮的浓度进行测定。计算提取率(R)，对提取率随提取时间的变化进行考察，结果见图1。

图1 提取时间对提取率的影响Fig.1 Effect of extraction time on yield

由图1 可知，提取时间在0 ～1 h，随着时间的延长葛根提取黄酮的提取率也迅速增加，提取时间在1 ～2.5 h，提取率趋于平缓，提取3 h 时提取率略有下降，可能是由于提取时间过长导致葛根黄酮氧化，从而使提取率降低。所以综合各种因素，葛根黄酮最佳提取时间为1.5 h。

2.1.2 物料比对提取率的影响 其它提取条件不变，考察提取率随物料比的变化，结果见图2。

图2 物料比对提取率的影响Fig.2 Effect of material ratio on yield

由图2 可知，料液比(g/mL)在1∶5 ～1∶8 时，提取率增加，料液比在1∶8 ～1∶16.7 时，提取率开始下降。考虑到成本则应按1∶8，1∶13 料液比提取，葛根黄酮处于较高的提取率，但是按1∶8 料液比提取后，所得溶液较少，对于后期分离纯化增加了难度，综合考虑，选择1∶13 为葛根黄酮最佳提取料液比。

2.1.3 乙醇体积分数对提取率的影响 提取率随乙醇体积分率的变化见图3。

图3 乙醇浓度对提取率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on yield

由图3 可知，随着提取所用溶液浓度的升高，葛根黄酮的提取率增大，乙醇浓度达到60%时，葛根的提取率达到最大2.64 mg/g。而后，随着乙醇浓度的增加，葛根黄酮的提取率略有降低，这可能是随着其浓度增加，一些醇溶性杂质和亲脂性成分溶出量增加，这些成分和葛根黄酮竞争同乙醇水分子结合，从而导致葛根黄酮提取效果的略有下降。同时考虑到成本因素，最佳乙醇提取浓度为40%。

2.1.4 提取温度对提取率的影响 提取率随提取温度的变化见图4。

图4 提取温度对提取率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on yield

由图4 可知，随提取温度的升高，葛根黄酮的提取率升高。温度升高有利于葛根黄酮扩散到乙醇溶液中。因此，葛根黄酮的提取最佳温度为60 ℃。

2.2 葛根中黄酮的纯化

2.2.1 树脂柱吸附及解吸 按照1.3 实验方法中的纯化步骤进行动态吸附和解吸实验，取50 mL 葛根黄酮提取液，并测定其中黄酮的浓度，然后以2 mL/min的流速通过柱子，测定流出液中黄酮的浓度，计算大孔吸附树脂对葛根黄酮的动态吸附量;再用60%乙醇进行解吸，以2 mL/min的流速通过柱子，测定解吸液中黄酮的浓度，计算大孔吸附树脂对葛根黄酮的动态解吸率，结果见表1。

表1 大孔吸附树脂纯化葛根黄酮Table 1 Purification of flavones from Kudzu root by macroporous adsorption resin

2.2.2 葛根黄酮纯化液的吸收曲线 按照1.3 节的实验方法，将纯化前后的葛根黄酮溶液分别稀释10 倍后，在200 ～400 nm 波长范围内，测定其紫外吸收曲线，结果见图5。

图5 葛根黄酮溶液的紫外吸收曲线Fig.5 Adsorption spectra of flavones from Kudzu root

由图5 可知，葛根黄酮提取液经LS-303 型大孔吸附树脂纯化，其紫外吸收在黄酮特征波长255 nm和350 nm 处峰形明显变窄，表明葛根黄酮提取液经LS-303 型大孔吸附树脂纯化后，杂质含量明显减少，黄酮纯度提高。

3 结论

(1)乙醇水溶液提取葛根黄酮，单因素实验表明，95%乙醇体积浓度40%，料液比(葛根/提取剂)1∶13 g/mL，60 ℃提取1.5 h，葛根黄酮的提取率达到2.64 mg/g。

(2)葛根黄酮提取液可用LS-303 型大孔吸附树脂进行纯化，提取液经LS-303 型大孔吸附树脂纯化后，杂质含量明显减少。

［1］ 张岩，薛兴亚，徐青，等. 葛根提取物高效液相色谱分析方法的优化［J］.色谱，2006，24(7):354-358.

［2］ 向大雄，李焕德，吴大勇，等. 不同纯化工艺对葛根总黄酮质量的影响［J］.中国药房，2002，13(6):328-330.

［3］ Yu Fu-Chieh，Lai Shih-Ming，Suen Shing-Yi.Extraction of flavonoid glycosides from ginkgo biloba leaves and their desorption separations using hydrophobic and anion-exchange membranes［J］.Separation Science and Technology，2003，38(5):1033-1050.

［4］ 陈亮.芹菜黄酮类物质提取与富集工艺研究［D］. 长沙:湖南农业大学，2007.

［5］ 刘翀，杨洋.生物类黄酮提取研究进展［J］.中外食品，2004(10):48-49.