蔓越莓原花青素的提取工艺及其体外抗氧化活性研究

柯春林，郭猛，王娣，赵大庆，孙兰萍

(蚌埠学院 生物与食品工程系，安徽 蚌埠 233030)

蔓越莓，也有人叫蔓越橘、小红莓，归属于杜鹃花科越橘属红梅台子亚属，目前在北美的一些地区被广泛种植，在我国的大兴安岭地区也比较常见［1］。蔓 越 莓 含 有 丰 富 的 原 花 青 素(34.3 mg/100 g)，具有抗氧化、延缓衰老、防治消化系统疾病、防治泌尿道感染、抗癌、保护口腔和牙齿等多种特殊功能［2］。原花青素是一种存在自然界的天然多酚，其主要结构是儿茶素、表儿茶素或者儿茶素与表儿茶素的聚合体，具有抗氧化、保护心血管、抗炎、抗菌、抗肿瘤和免疫调节等生物活性［3］。它是一种作用力很强的抗氧化剂，能有效地降低羟自由基和超氧根阴离子自由基的含量，保护DNA 细胞免受自由基引起的氧化损害，还可以有效地控制脂质过度氧化［4］。虽然国内外对蔓越莓的研究较多，但是还没有关于我国大兴安岭蔓越莓原花青素相关的研究报道。

基于原花青素的多种生物活性，以及目前国内外正在进行的原花青素开发研究背景，探索蔓越莓原花青素的制备条件和生物活性的研究，不仅可以为保障人类健康发挥着不可替代的作用，而且还可以创造出更大的经济效益，具有潜在的市场前景。尽管原花青素的制备方法很多，如有机溶剂提取、微波辅助提取、超声波辅助提取、超临界二氧化碳萃取、酶提取法等方法［5］，但考虑到乙醇是一种常见的食品原料，无毒性、价格低且回收利用很方便。因此，本文以我国大兴安岭蔓越莓为材料，研究蔓越莓原花青素的乙醇提取工艺以及其体外抗氧化活性，以期为我国蔓越莓资源开发及利用提供理论依据。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

大兴安岭野生蔓越莓;儿茶素标准品;香草醛、三羟基氨基甲烷盐酸盐、邻苯三酚、盐酸、乙醇、甲醇、浓盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三氯乙酸、铁氰化钾、三氯化铁等均为分析纯。

722 可见光分光光度计;JJ500 型精密电子天平;DS-1 高速组织捣碎机;PHB-4 酸度计;DZKW-4型恒温水浴锅;LXJ-0B 型离心机;CS101-2AB 电热鼓风干燥箱;RE-52A 旋转蒸发仪;SHB-III 循环水式多用真空泵等。

1.2 原花青素的提取

蔓越莓55 ℃烘干，粉碎(过60 目筛)，脱脂(石油醚法)，除蛋白(三氯乙酸法)。取2.0 g 蔓越粉末，用75% 乙醇提取，料液比1 ∶10 g/mL，温度70 ℃，时间30 min。过滤，取滤液，旋转蒸发浓缩，冷冻，干烘，得原花青素粗品。

1.3 原花青素的测定

原花青素在偏酸性情况下很不稳定，4→8 连接键容易在酸的作用下解开，在原花青素提取液中加入盐酸-香草醛显色剂，可以使溶液变色［6］。本实验以儿茶素为标准品，建立线性回归方程，并采用香草醛-浓盐酸法测定样品在495 nm 吸光度，根据标准曲线换算原花青素的含量［7］，计算得率。

原花青素得率(%)=［m×V1×d×100］/［103×M］

式中 m——查标准曲线样品液OD495对应的原花青素含量，mg/mL;

V1——待测样品的取样体积，mL;d——样品溶液稀释倍数;M——样品取样质量，g。

1.4 体外抗氧化活性实验

1.4.1 对超氧根阴离子自由基(O·－

2 )的影响 采用邻苯三酚自氧化法［8］，向试管中滴加浓度50 mmol/L的三羟基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液(pH 8.2)4.5 mL，加去离子水4. 2 mL，混合均匀后在25 ℃水浴锅中水浴20 min，拿出，添加0.3 mL 邻苯三酚溶液，立即摇匀，反应4 min。滴加0.3 mL 的6 mol/L盐酸终止反应，测定吸光度A325nm，记为A0，并以邻苯三酚溶液作为空白对照。再滴加不同浓度的蔓越莓原花青素溶液，作为待测液，测定原花青素的吸光度A325nm，记为A。计算不同浓度待测物对的清除率。

清除率=(A0－A)/A0×100%1.4. 2 还原能力的测定 运用我们以前的方法［9］，分别取1 mL 不同浓度的原花青素待测液与PBS 缓 冲 液0. 2 mL 混 合，准 确 加 入1. 5 mL K3Fe(CN)6溶液(1%)，在50 ℃水浴锅中水浴20 min。拿出，用流水冷却，加三氯乙酸1 mL，混匀后离心10 min。取上清2 mL，加0. 5 mL FeCl3(0.3%)和3 mL 去离子水，测定吸光度A700nm。以水代替FeCl3溶液作空白对照。以吸光值(A1－A2)表示样品还原力，A1表示样品管吸光值，A2表示样品空白管吸光值。

2 结果与讨论

2.1 乙醇浓度

按料液比为1∶10 的比例加入不同浓度的乙醇溶液，70 ℃水浴30 min，测定吸光值，结果见图1。

图1 乙醇浓度对原花青素得率的影响Fig.1 Effect of alcohol concentration on proanthocyanidins yield

由图1 可知，当提取剂浓度在75%以下时，得率是递增的，75%达到最大值，浓度继续升高时得率下降。这是因为水有穿透植物细胞的作用，如果没有水的存在，无法提取出有效成分。但另一方面，非结合水如果大量的存在，能溶于水的杂质一定会增加，这些因素都会干扰原花青素的提取［10］，所以，确定乙醇浓度为75%。

2.2 料液比

乙醇浓度为75%，加入不同比例的乙醇液，70 ℃水浴30 min，测定吸光值，结果见图2。

图2 料液比对原花青素得率的影响Fig.2 Effect of solvent/material ratio on proanthocyanidins yield

由图2 可知，原花青素的得率与料液比存在量的关系，1∶10 达到最大，但是当料液比继续增加时，得率略有降低。这是由于蔓越莓中的原花青素在1∶10 g/mL 时大致全部溶出。考虑到后续步骤以及经济效益，所以料液比选择1∶10 g/mL。

2.3 提取温度

乙醇浓度75%，料液比为1∶10 g/mL，混合均匀后分别在50，60，70，80，90 ℃水浴锅中提取30 min，测定吸光值，结果见图3。

图3 提取温度对原花青素得率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on proanthocyanidins yield

由图3 可知，随温度升高，原花青素得率提高，70 ℃时达到最大值，继续升高温度，得率降低。因为原花青素是易氧化物质，结构不是很稳定，超过最佳温度，原花青素的结构的破坏会越来越大，氧化程度越高，有效成分损伤就越多［11］。所以，提取温度选择70 ℃。

2.4 提取时间

图4 提取时间对原花青素得率的影响Fig.4 Effect of extraction time on proanthocyanidins yield由图4 可知，随着时间的增加，得率逐步上升，

乙醇浓度75%，料液比1∶10 g/mL，混合均匀后在70 ℃水浴锅中分别提取20，30，40，50，60 min，测定吸光值，结果见图4。40 min 时，得率最大，时间持续上升，得率略有降低。这是由于原花青素结构不稳定，提取时间增加会使部分原花青素结构遭到破坏分解。所以，时间取40 min为最优条件。

2.5 正交实验

在单因素实验基础上采用正交软件进行正交实验，因素水平见表1，结果见表2。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels table

表2 正交实验结果Table 2 Orthogonal test

由表2 可知，对蔓越莓原花青素得率的影响:料液比＞提取温度＞乙醇浓度＞提取时间，最佳提取条件为A3B1C2D1。即料液比1∶15 g/mL，乙醇浓度65%，温度70 ℃，时间30 min。

2.6 抗氧化

2.6.1 蔓越莓原花青素对O·－2的影响 原花青素能够抑制邻苯三酚的自氧化，清除超氧阴离子自由基［12］。

由图5a 可知，含原花青素的蔓越莓乙醇提取液对超氧根阴离子的清除均随着浓度的增加而提高，当原花青素浓度超过9.8 μg/mL 时，其对O·－2的清除作用明显呈线性上升趋势。当原花青素浓度达到24.5 μg/mL 时，其清除率达到55.7%。

图5 蔓越莓乙醇提取液的抗氧化活性Fig.5 Cranberry ethanol extract antioxidant activity a.超氧阴离子清除能力;b.还原力

2.6.2 还原能力［13］原花青素还原力的测得结果见图5b。

由图5b 可知，随着原花青素浓度的增加，还原力逐渐增加。当原花青素浓度超过2. 66 μg/mL时，其还原力上升趋势尤其明显。

3 结论

(1)以乙醇提取蔓越莓中原花青素的最佳工艺参数为:料液比1 ∶15 g/mL，乙醇浓度65%，温度70 ℃，时间30 min。

(2)体外抗氧化实验表明，含原花青素的蔓越莓乙醇提取液具有抗氧化活性，表现出较好的清除超氧根阴离子自由基效果和较高的还原能力，而且其抗氧化活性随原花青素浓度的增加呈上升趋势。

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