甜瓜CBL基因的鉴定和特征分析

刘明毓　纪复勤　马强　胡向树　李利斌　董玉梅

摘要：CBL基因在植物逆境应答和生长发育中具有重要功能，但有关甜瓜CBL基因的研究尚未见报道。本文利用比较基因组学的方法，从甜瓜基因组中鉴定出7个CBL基因，并对其基因组分布、基因结构、系统进化和顺式调控元件进行了分析。结果显示，7个甜瓜CBL基因分布在不同的染色体上，均含有8个外显子，编码区在642～738bp，编码的蛋白均含有3个结合钙离子的EF手结构和能够与CIPK互作的FPSF位点。而且，在它们的上游基因序列中存在多个环境应答元件，且各不相同，暗示它们可能具有多种生物学功能。本文为进一步研究甜瓜CBL基因的功能奠定了基础。

关键词：甜瓜；CBL；结构；进化；顺式元件

中图分类号：S652.01

文献标识号：A

文章编号：1001-4942（2015）10-0017-05

植物中一类与钙结合的CBL蛋白（类钙调磷酸酶B亚基蛋白，Calcineurin-B like protein）能够感受钙信号，在植物非生物逆境应答、矿质营养吸收和ABA信号转导过程中具有重要功能。CBL主要是通过和一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（CIPK）互作来调控下游基因的表达，以响应各种不同的逆境信号，这一信号系统在植物界广泛存在。目前有关植物CBL的研究日益受到关注，从模式植物拟南芥和水稻不断向其他作物扩展，其中以拟南芥CBL的研究最为深入。拟南芥CBL1和CBL9可以与CIPK23结合，调控下游基因AKT1的表达，从而促进钾离子的吸收；CBL1还参与了ABA的信号转导、冷胁迫应答过程以及植物对葡萄糖和赤霉素的响应；CBL2和CBL3能够调控植物生长、种子大小和胚胎发育；CBLA/SOS3和CBL10蛋白可以和CIPK24（SOS2）结合，调控下游基因SOS1（钠离子/质子-反向运输载体）的表达，促进细胞中钠离子的排出，从而提高植物对盐胁迫的抗性；拟南芥CBL5过表达可以提高植物的抗旱能力；CBL9还可调控ABA的合成及应答反应。最近报道拟南芥的CBL2和CBL3在高镁胁迫应答中具有重要功能。

甜瓜作为重要的园艺作物，其非生物逆境抗性对于生产具有重要意义。但有关甜瓜CBL基因的研究尚未见报道。本文利用比较基因组学的方法从甜瓜基因组中鉴定出7个CBL基因，并对其染色体分布、分子特征、遗传进化及顺式调控元件进行了分析，为进一步研究它们在甜瓜逆境应答中的功能奠定了基础。

1研究方法

利用拟南芥的CBL基因序列在NCBI数据库中（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索比对甜瓜的基因组序列，寻找甜瓜的CBL基因序列，对鉴定出的CBL基因进行结构分析和遗传进化分析，并对启动子序列中的顺式元件进行预测。结构分析利用GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）在线进行，遗传进化分析利用MEGA4.1进行，采用Bootstrap test-Neighbor Joining方法，重复1000次运算。蛋白序列比对采用DNAMAN方法，顺式元件预测采用PlantCARE软件进行在线分析。亚细胞定位预测在WoLF PSORT（http：//wolfpsort.org/）中进行。蛋白基序分析用Motif Scan（http：//myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan）在线进行。

2结果与分析

2.1甜瓜CBL基因的鉴定和特征分析

笔者从甜瓜基因组中鉴定出7个CBL基因（表1），分别命名为CmCBL1～CmCBL7。它们在基因组中的分布是不均匀的，其中，CmCBL1位于3号染色体，CmCBL2位于4号染色体，CmCBL7位于8号染色体，其余4个基因均位于6号染色体。结构分析显示，它们都含有8个外显子。编码区序列大小是600～750bp，差异不大，但是基因组序列大小差异明显（图1）。亚细胞定位预测显示，它们编码的蛋白分别定位在细胞质、细胞核或者叶绿体中。

2.2甜瓜CBL基因的系统进化和蛋白结构分析

基因的遗传进化分析可为基因功能研究提供重要的线索。分析结果显示，甜瓜的CBL基因分为三类（图2）：CmCBL2/3/4/6为一类；CmCBL1单独为一类；而CmCBL5/7为第三类。CmCBL1与AtCBL10直系同源，CmCBL2与AtCBL1直系同源；CmCBL3与AtCBL5直系同源；CmCBL4与AtCBL4直系同源；CmCBL5/7与AtCBL2/3直系同源；CmCBL6与AtCBL9直系同源。序列比对分析发现，甜瓜CBL蛋白含有多个保守的氨基酸残基和位点（图3），其中包括能与蛋白激酶CIPK互作的位点FPSF。蛋白基序分析发现，它们都含有3个EF手结构，1～2个磷酸化位点；多数还含有糖基化位点和豆蔻酰化位点（表2）。只有CmCBL2含有一个酰胺化位点。从结构上看，它们能与钙离子结合，且能与CIPK互作。

2.3甜瓜CBL基因的顺式调控元件分析

顺式调控元件在基因表达调控中具有重要功能。分析发现，在甜瓜CBL基因的上游序列中存在多个逆境和激素应答元件，且在种类和数目上各不相同（表3）。其中，CmCBL2/4/6/7含有脱落酸应答元件ABRE，CmCBL2/3/4/5/6具有真菌激发子应答元件Box-W1；CmCBL3/6/7具有茉莉酸甲酯应答元件CGTCA-motif；它们都含有赤霉素应答元件GARE-motif或者p-box；Cm-CBL1/2/3/6/7有热胁迫应答元件HSE；CmCBL4还有一个冷胁迫应答元件LTR；CmCBL3/4/6有干旱诱导元件MBS；除CmCBL4外，还都有逆境和防卫应答元件TC-rich repeats；CmCBL2/3/4/5/6都有水杨酸应答元件；CmCBL2/3/4/6有防卫应答元件。

3结论与讨论

本文从全基因组水平对甜瓜CBL基因进行分析，结果显示甜瓜基因组中存在7个CBL基因，分别位于不同的染色体上。它们在进化上分为3个不同的类群，在外显子数目上保守，均为8个。它们编码的蛋白都具有EF手结构、与蛋白激酶CIPK的互作位点FPSF和多个保守的氨基酸残基，可能这些位点为其行使功能所必须。在它们的上游序列中，都存在多个激素和逆境应答元件，且各不相同。它们可能不仅应答非生物逆境，而且也可应答生物逆境。在水稻和番茄中最近研究的成果也间接证实了这一点。根据系统进化和顺式调控元件分析的结果以及拟南芥CBL研究的进展，笔者认为甜瓜CBL基因具有多样的生物学功能：CmCBL1可响应赤霉素信号和热胁迫、盐胁迫及生物逆境；CmCBL2可响应ABA、赤霉素和水杨酸信号以及参与植物防卫应答反应；CmCBL3参与干旱、热以及病原物胁迫应答；CmCBL4参与ABA信号及盐、冷、干旱等胁迫应答；CmCBL5/7参与种子发育和盐胁迫应答；CmCBL6参与钾离子吸收和ABA等信号应答。本文为进一步研究甜瓜CBL的功能奠定了基础。endprint