2012年河北省围场县马铃薯晚疫病菌表型及基因型分析

何佳昱　丁明亚　杨志辉　朱杰华

摘要：对2012年采自河北省围场县永和栈、银窝沟、克勒沟、小苇子沟、扣花营5个地点的60株晚疫病菌测定了其交配型、甲霜灵抗性、mtDNA单倍型、SSR基因型，结果表明，60株晚疫病菌全部为A1交配型，甲霜灵高抗菌株58株，占96.67%；敏感菌株2株，占3.33%。采用以PCR方法为基础的mtDNA单倍型检测新方法共鉴定出ⅠR3、ⅡR3、ⅡR2 3种mtDNA单倍型。其中，ⅠR3单倍型为该群体的优势单倍型，占80.0%；ⅡR3、ⅡR2 分别占18.3%、1.7%。同时，还利用具有多态性的8对引物测定了该群体的SSR基因型，共检测到18个等位基因、5种基因型。SSR聚类结果表明，SSR基因型与菌株对甲霜灵抗性有一定相关性，而与交配型和地理来源无相关性。围场县晚疫病菌群体结构比较单一，遗传多样性程度较低。

关键词：致病疫霉；甲霜灵抗性；mtDNA单倍型；SSR基因型

中图分类号： S435.32 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0179-04

河北省围场县是中国人民共和国农业部命名的第一批国家级马铃薯生产基地县，是“中国马铃薯之乡”，马铃薯年种植面积稳定在 30 000 hm2，年产鲜薯5亿～6亿kg，年产值 3 000万～4 000万元[1]。由于马铃薯晚疫病的发生与流行，马铃薯产量损失约 4 500 kg/hm2，经济损失超过2 000元/hm2[2]。晚疫病的发生与流行和病菌群体遗传结构变化有密切联系[3-5]。了解一个区域晚疫病菌的群体结构是制定该地区晚疫病防控技术的理论基础。2000年，朱杰华等在围场县首次发现了晚疫病菌A2交配型[6]。2002年，王文桥等在围场县再次发现A2交配型，但之后检测中并未发现A2交配型[7-8]。2006年，姚国胜等报道，围场县甲霜灵高抗菌株占被测菌株的88.5%[9]。2012年，王文桥等发现，河北省甲霜灵抗性菌株所占比例由2007年的100%降为2008年的664%，2009年又回升为74.2%[8]。为了更好地揭示晚疫病的群体结构、动态变化，国内学者采用了分子技术对其进行研究[10]。2000年，朱杰华等采用RAPD方法研究了DNA多态性与A2交配型之间的关系，认为两者之间具有一定的相关性，各地的晚疫病菌系出现不同程度的群体分化现象[11]。2008年，杨志辉等利用12对AFLP引物组合对1996—2002年采自河北省的晚疫病菌菌株进行PCR扩增，结果表明，群体结构比较简单，遗传多样性较低[12]。姚国胜等首次利用SSR标记研究晚疫病菌的基因型结构，利用Pi4B、Pi4G 2对引物于河北省47株马铃薯晚疫病菌中鉴定出4个SSR基因型，并发现1种新的基因型F-06[13]。2009年，陈良华对1997—2007年采自围场县的致病疫霉菌株mtDNA进行单倍型测定，仅发现Ⅱa 1种单倍型[10]。本研究测定2012年围场县晚疫病菌群体的表型、基因型，明确当前该地区晚疫病菌群体结构，与以前群体的性状进行比较，了解围场县晚疫病菌群体的动态变化，为围场县马铃薯晚疫病防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 2012年在围场县永和栈、银窝沟、克勒沟、小苇子沟、扣花营等5个地点共采集并分离60株单病斑马铃薯晚疫病菌。

1.1.2 供试药剂 98%甲霜灵原药由河北省双吉化工有限公司提供，二甲亚砜（DMSO）由北京博奥拓达科技有限公司生产。

1.1.3 供试培养基 黑麦培养基：黑麦60 g，蔗糖20 g，琼脂粉12 g，蒸馏水定容至1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 交配型测定 采用对峙培养法将供试菌株与A1、A2交配型标准菌株分别接种在黑麦培养基平板上，置于18 ℃生化培养箱中黑暗培养，显微镜观察菌落交界处是否出现卵孢子。若待测菌株与A1产生卵孢子，则待测菌株为A2交配型；若待测菌株与A2产生卵孢子，则待测菌株为A1交配型[14]。

1.2.2 甲霜灵敏感性测定 将供试菌株分别接种在含甲霜灵0、5、100 μg/mL的黑麦培养基平板中央，置于18 ℃生化培养箱中黑暗培养，待对照菌落直径大于50 mm时，参照Lee等的方法[15]测量并记录菌株甲霜灵敏感性。

1.2.3 mtDNA单倍型测定 采用Yang等的方法[16]对供试菌株的2个高变区即 HVRi、 HVRii进行PCR扩增，引物序列见表1。对致病疫霉线粒体2个高变区多态性片段进行分析，致病疫霉存在6种线粒体单倍型即 ⅠR1、ⅠR2、ⅠR3、ⅡR1、ⅡR2、ⅡR3。

1.2.4 SSR基因型测定 选取8对具有多态性的微卫星标记测定晚疫病菌SSR基因型，即张宏磊等开发的5对引物（I-07111、I-07122、F5-22735、E-14923、E-17965）[17]和Li等开发的3对引物（D13、PinfSSR8、PinfSSR4）（表2）[18]。

2 结果与分析

2.1 交配型测定

2012年围场县采集的60株晚疫病菌交配型组成单一，均为A1交配型，未发现A2交配型或自育型菌株，表明围场县马铃薯主产区发生有性生殖的可能性很小。

2.2 甲霜灵敏感性测定

甲霜灵敏感性测定结果显示，围场县60株致病疫霉中，抗性菌株占绝对优势。高抗菌株58株，占96.67%；无中抗菌株；敏感菌株2株，占3.33%。2株敏感菌株分别是JW12-25、JW12-59，分别采自克勒沟、银窝沟，由此可知，克勒沟、银窝沟地致病疫霉群体仍有很少比例的甲霜灵敏感菌株存在，而其他采集地可能全部为抗性菌株。

2.3 mtDNA单倍型分析

以mtDNA单倍型方法对60株致病疫霉共鉴定出ⅠR3（泳道1、2、5、6、7、10）、ⅡR2（泳道4）、ⅡR3（泳道3、8、9）3种单倍型，琼脂糖凝胶电泳检测（图1）。mtDNA单倍型在致病疫霉群体中的分布比率如图2所示，从高变区HVRi来看以Ⅰ型为主，占80%；从高变区HVRii来看，R3型占绝对优势，占98%，R2型仅占2%，无R1型。从2个高变区HVRi、HVRii组合来看，48株致病疫霉mtDNA单倍型为ⅠR3，占800%；11株单倍型为ⅡR3，占18.33%；仅检测到1株单倍型为ⅡR2，占1.67%。endprint

由图3可知，永和栈、银窝沟、克勒沟、小苇子沟、扣花营等5个采样点中，ⅠR3分布最广，在每个采样点都有分布，且绝大多数都是该地区的优势线粒体单倍型。ⅡR3分布也很广，除小苇子沟未发现外，其他4个采样点都有发现。ⅡR2仅在克勒沟发现了1株。综上所述，克勒沟的晚疫病菌线粒体单倍型最多，小苇子沟采样点晚疫病菌线粒体单倍型最少，仅存在ⅠR3，说明围场县晚疫病菌群体以ⅠR3为主，占80%，不同地区间晚疫病菌群体也存在着一定的遗传差异。

2.4 SSR基因型分析

利用8对SSR引物对60株被测菌株进行PCR扩增，分析电泳图谱，共检测到18个等位基因。根据8个基因座上等位基因的组合，将被测菌株分为5个基因型，分别用大写英文字母A、B、C、D、E来表示，基因型A 38株，占63.33%，且在5个采样点均有分布，具绝对优势；基因型D有11株，占18.33%，仅次于基因型A，主要分布在银窝沟；基因型B、基因型C分别有8、1株，分别占13.33%、1.67%，主要分布在克勒沟与银窝沟；基因型E有2株，占3.33%，分别来自克勒沟、银窝沟。5个采样点中，银窝沟基因型最丰富，包含A、B、D、E 4种SSR基因型；其次为克勒沟与扣花营，分别包含A、B、E和A、C、D 3种SSR基因型；永和栈与小苇子沟的基因型比较单一，均为基因型A。由此可知，不同地区致病疫霉SSR基因型之间有一定差异。根据8个微卫星标记的扩增结果进行聚类分析（图4），当相似系数为0.75时，被测菌株分为α、β 两大分支，其中α分支包括58个菌株，包括A、B、C、D 4种SSR基因型，且均为甲霜灵高抗菌株；β分支仅有2个菌株，仅包括1种SSR基因型，为甲霜灵敏感菌株。由此可知，菌株的SSR基因型与甲霜灵抗性间存在一定的相关性，甲霜灵抗性群体数量、遗传多样性都明显高于甲霜灵敏感群体。此外，围场县晚疫病菌群体SSR基因型与地理来源、线粒体单倍型无相关性。

3 结论与讨论

从交配型、甲霜灵抗性等表型测定结果来看，近10年来围场县晚疫病菌群体结构几乎未发生变化。本研究结果表明，2012年采自围场县的60株晚疫病菌均为A1交配型，绝大多数为甲霜灵高抗菌株，占96.67%。朱杰华等[6]、王文桥等[7]发现河北省存在A2交配型。沈江卫等研究表明，采自围场县的晚疫病菌全部为A1型。这意味着晚疫病菌A2交配型在2000年前后可能通过种薯调运传播到围场县，之后随着晚疫病菌群体的年度间遗传飘变而消失，可能是由于A2交配型病菌不适合围场县的气候类型[19]。李炜等研究表明，采自围场县的49株晚疫病菌中，40.8%表现高度抗性，49%表现中度抗性[20]。陈良华等对甲霜灵抗性的检测结果表明，高抗菌株分别占被测菌株的88.5%与72.3%[21]。这说明河北围场晚疫病菌群体从20世纪90年代已对甲霜灵产生了普遍的抗药性，且抗性程度高，但生产中仍有不少农户还采用含有甲霜灵成分的药剂来防控马铃薯晚疫病，因此应加强对当地农民的教育，让他们不再使用该类药剂防控晚疫病，以免浪费人力物力，给当地环境造成恶劣影响。

以PCR为基础的线粒体单倍型检测方法更有利于揭示晚疫病群体的多样性，发现其动态变化。2008年，Guo等报道，中国北方地区马铃薯晚疫病菌mtDNA单倍型单一，仅存在Ⅱa 1种[22]。本研究采用以PCR为基础的mtDNA单倍型检测方法，在围场县共发现了ⅠR3、ⅡR2、ⅡR3 3种单倍型，其中ⅠR3占80.00%，其次为ⅡR2，占18.33%，此外还发现了1株ⅡR2单倍型。笔者所在实验室对围场县致病疫霉mtDNA单倍型近几年监测结果表明，2004年仅检测到ⅠR3单倍型；2006年检测到ⅠR3、ⅡR2 2种单倍型，90%的菌株为ⅠR3，10%的菌株为ⅡR2；2007年检测到ⅠR3、ⅡR2、ⅡR3 3种单倍型，58.82%为ⅠR3，35.29%为ⅡR2，剩余1.67%为ⅡR3；2011年检测到ⅠR3、ⅡR32种单倍型，82.35% 为ⅠR3，17.65%为ⅡR3，这表明围场县马铃薯晚疫病菌群体年度间不断发生变化。

本研究结果表明，SSR基因型与晚疫病菌对甲霜灵抗性有一定相关性，这与吴婧莲等的研究结果[23]一致。2002年，Knapova 等利用AFLP、SSR 2种分子标记对采自瑞士及法国的马铃薯、番茄的致病疫霉群体结构进行了分析，结果表明，AFLP、SSR分子标记所检测遗传多样性与致病疫霉地理来源、生理小种、交配型、甲霜灵抗性等表型之间并无相关性[24]。姚国胜等对河北省、黑龙江省致病疫霉群体结构进行了分析，结果表明，SSR分子标记与甲霜灵抗性、交配型也没有相关性[13]。Mahuku等认为，可能是交配型、生理小种和对甲霜灵抗性等表型变异仅与1个或几个基因变异程度有关[25]。本研究结果表明，SSR基因型与甲霜灵抗性具有相关性，笔者认为，这主要是由于敏感菌株在群体中的比例极小，因此它形成了1个单独的SSR基因型。围场县马铃薯晚疫病菌群体结构一直在改变，由于线粒体单倍型和SSR基因型较交配型和甲霜灵抗性等表型性状相比具有更高的多样性，因此在晚疫病菌群体结构和动态演化中具有更重要的作用。

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