大鼠局灶性脑挫伤后p35及p25的表达变化

王汉志，李如波，王正印，张立军

（1.中国医科大学法医学院法医病理学研究室，辽宁沈阳 110001；2.苏州市公安局，江苏苏州 215000；3.调兵山市公安局，辽宁调兵山 112700）

大鼠局灶性脑挫伤后p35及p25的表达变化

王汉志1，2，李如波1，王正印1，张立军3

（1.中国医科大学法医学院法医病理学研究室，辽宁沈阳 110001；2.苏州市公安局，江苏苏州 215000；3.调兵山市公安局，辽宁调兵山 112700）

目的探讨大鼠局灶性脑挫伤后脑中p35和p25表达变化的时间规律性，为脑损伤时间推断提供更多依据。方法50只成年雄性SD大鼠随机分为损伤即刻（0h）组，伤后6h、12h、24h、3d、5d、7d、10d组，同时设立正常组和假手术组，每组5只，建立大鼠局灶性脑挫伤模型，运用HE、免疫组织化学染色及Western印迹法等方法检测损伤不同时间后损伤周边区脑组织p35及p25的蛋白表达。结果正常组和假手术组蛋白表达较多p35和少量p25。在局部脑挫伤后，p35随时间呈现单峰变化，p25随时间呈现双峰变化。结论大鼠局灶性脑挫伤后p35和p25的表达呈现不同规律性并有较好的时间相关性，可为脑损伤时间推断提供较好的依据。

法医病理学；脑损伤；p35；p25；大鼠

脑损伤是法医鉴定工作中的常见损伤之一，脑损伤时间的推断对于各类案件的侦查和审判具有重要意义。目前法医病理学者通过对基质金属蛋白酶-3 （matrix metalloproteinase-3，MMP-3）、caspase-3、突触后致密物-95（postsynaptic density-95，PSD-95）及Homer蛋白等特异性蛋白在脑损伤后表达变化规律的研究[1-4]，为脑损伤时间推断提供了科学依据。p35是一种有丝分裂后在神经元中表达的细胞周期蛋白依赖性激酶5（cyclin dependent kinase 5，Cdk5）特异性激活因子，其蛋白表达水平决定神经元中Cdk5的活性。p35/Cdk5激酶复合物可以磷酸化多种底物，参与神经元迁移、轴突导向、微管稳定性调节等，与神经系统发育和神经元正常功能的维持密切相关。在细胞毒性谷氨酸盐、缺血缺氧等刺激下，p35可被钙依赖性蛋白酶（calpain）裂解为p25[5]，p25具有更强的激活Cdk5的功能和更好的稳定性[6]，可过度激活Cdk5而引起细胞凋亡等病理变化。本实验通过建立大鼠局灶性脑挫伤模型[7]，检测损伤不同时间后脑中p35和p25表达的变化并分析其时间规律性，为脑损伤时间的推断提供更多有效的科学依据。

1 材料与方法

1.1 分组及模型建立

1.1.1 实验动物分组

健康成年雄性SD大鼠50只，体质量280～310 g（由中国医科大学动物实验中心提供），随机分为10组，包括正常组，假手术组，损伤即刻（0 h）组，伤后6 h、12h、24h、3d、5d、7d、10d组，每组5只。

1.1.2 动物模型制备及取材

损伤组将大鼠乙醚诱导麻醉后称重，4%水合氯醛（30mg/kg）腹腔注射麻醉，俯卧位固定于手术台，头部备皮后正中切开头皮，于人字缝前2mm、矢状缝旁2mm处钻一直径5mm的圆形骨窗，保持硬脑膜完整。用30g重锤从25cm高处落下，打击暴露的脑组织，建立大鼠局灶性脑挫伤模型。假手术组以相同方法钻骨窗，但不进行打击。正常组不进行手术。术后大鼠分笼饲养，保持垫料清洁及空气通畅。

分别于术后设定时间手术取出脑组织，沿冠状方向将挫伤区脑组织分为两份，一份放入4%多聚甲醛溶液中固定后制作蜡块，用于HE染色和免疫组织化学染色；另一份用于Western印迹法检测蛋白表达。

1.2 试剂

兔抗大鼠p35/p25多克隆抗体（ab10570，美国Abcam公司），SP-9002免疫组织化学染色试剂盒（美国ZYMED公司），浓缩型DAB试剂盒（ZLI9018，北京中杉金桥生物技术有限公司），多克隆山羊抗兔IgG （ZB-2305，北京中杉金桥生物技术有限公司），ECL发光剂（sc-2048，美国Santa Cruz公司）。

1.3 HE染色

常规脱蜡，水化，苏木素染色5min，1%盐酸乙醇溶液分化，自来水洗15 min，伊红复染3 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.4 免疫组织化学染色

常规脱蜡，水化，微波修复，PBS充分浸洗，滴加3%过氧化氢灭活15min，PBS浸洗，滴加封闭用山羊血清，保湿盒内孵育1 h，滴加一抗，4℃过夜，PBS浸洗，滴加二抗，保湿盒内孵育30 min，PBS浸洗，滴加辣根过氧化物酶标记的SP试剂，保湿盒内孵育30min，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片。

1.5 Western印迹法

将提取的脑组织放入2 mL微量离心管中，并于冰上剪碎，加入预冷的细胞裂解液，匀浆。4℃下以离心半径5.5 cm，12 000 r/min，离心15 min，取上清液，共3次，用BCA法测定蛋白浓度。先后灌注12%分离胶和4%浓缩胶，蛋白样品加适当比例上样缓冲液，混匀并于100℃加热5 min，向泳道内加入20 μL样品（含50 μg总蛋白）及标准分子质量Marker，电泳，湿转法将蛋白转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭4h，滴加一抗4℃过夜，滴加HRP标记的二抗，室温下孵育2 h，TBST充分洗膜后滴加ECL发光液进行发光。

1.6 统计学分析

用Image Pro Plus 6.0图像分析系统对免疫组织化学染色阳性的细胞进行计数分析，显微镜下，神经元胞质出现棕黄色为阳性着色，每张切片在脑挫伤区周围200μm范围内随机选取5个高倍视野（400倍），计算阳性细胞数、细胞总数以及阳性细胞率。采用上海天能公司GIS-700D凝胶图像分析系统对杂交条带进行扫描，以标准分子质量Marker作为标识，相对分子质量在20000～40000为目标阳性谱带。以平均灰度值分析各个时间段条带的浓度和大小。实验数据以±s表示，采用SPSS 17.0软件统计分析，应用方差分析进行统计学处理，组间比较用t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 HE染色结果

正常组和假手术组神经元形态、结构正常，核大、圆形、空亮，核仁明显，胞质较少。神经胶质细胞胞核深染，胞质少。伤后0～12h组可见挫伤局部蛛网膜下腔出血，脑皮质及深层脑组织出血，挫伤灶周围神经元核仁不清，尼氏体减少或消失，伤后3 d可见大量胶质细胞增生，伤后5～10d挫伤区出血减少，细胞周围间隙增宽，坏死组织吸收。

2.2 免疫组织化学染色结果

正常组和假手术组p35/p25抗体阳性染色细胞较多，阳性染色较深（图1A）；伤后0 h、6 h挫伤周边区阳性细胞数减少，阳性染色变浅（图1B）；伤后12h阳性细胞数和阳性染色降低最明显（图1C）；伤后24 h阳性细胞数开始增多，伤后3～10 d阳性细胞数逐渐增多，阳性染色逐渐加深（图1D～F），并于伤后5d基本恢复至正常水平（图1E）。脑挫伤后不同时间p35/p25免疫组织化学染色阳性细胞率见表1。

图1 大鼠脑组织p35/p25免疫组织化学染色SP×400

表1 各组p35/p25免疫组织化学染色阳性细胞率（n=5，±s）

表1 各组p35/p25免疫组织化学染色阳性细胞率（n=5，±s）

注：1）与相邻上组比较，P〈0.05

组别阳性细胞率正常0.70±0.03假手术0.67±0.03伤后0h0.49±0.051）伤后6h0.48±0.03伤后12h0.42±0.061）伤后24h0.53±0.071）伤后3d0.58±0.03伤后5d0.67±0.051）伤后7d0.69±0.10伤后10d0.65±0.06

2.3 Western印迹法结果

正常组和假手术组p35蛋白表达量较多，挫伤后出现下降，于12 h降至低峰，随后表达量逐渐升高，伤后5d时p35蛋白基本恢复正常表达量，呈现单峰变化。

在正常组和假手术组中仅有少量p25蛋白，挫伤后蛋白量升高并于6h达到高峰，随后下降，24h降至低峰，之后再次升高，5d时出现第二次高峰，之后蛋白量逐渐下降，呈现双峰变化（图2，表2）。

图2 各组p35和p25的蛋白表达

表2 各组p35和p25蛋白表达谱带的灰度值变化（n=5，±s）

表2 各组p35和p25蛋白表达谱带的灰度值变化（n=5，±s）

注：1）与相邻上组比较，P〈0.05

组别正常假手术伤后0h伤后6h伤后12h伤后24h伤后3d伤后5d伤后7d伤后10d p35 242.04±8.37 239.90±7.87 116.53±12.411）111.65±10.11 80.52±5.721）108.11±15.121）184.97±14.701）238.06±11.911）235.70±11.74 235.45±13.53 p25 69.42±4.37 58.64±1.99 193.93±15.281）207.75±8.57 107.40±12.971）83.17±7.861）89.16±5.78 136.84±10.011）67.02±6.911）66.56±5.66

3 讨论

p35在体内主要通过泛素-蛋白酶体途径降解，p25具有p35活性所需的全部氨基酸序列[8-11]，p25与Cdk5结合形成激酶复合物可过度磷酸化其适宜底物，如微管相关蛋白tau引起神经丝缠结，导致细胞凋亡[12]。

calpain是一种钙离子依赖性半胱氨酸蛋白酶，在神经元中含量丰富，主要以无活性的酶原形式存在于细胞质中，其活性主要由钙离子浓度调节。calpain分为两个亚型：μ-calpain和m-calpain，分别表达于神经元和神经胶质细胞中[13-14]。当calpain被钙离子激活，其N末端结构域裂解变为激活型，可以将p35裂解为p25。有实验[15]表明，在大鼠局灶性脑损伤模型中calpain的表达随损伤时间呈规律性变化，损伤15min后calpain表达增强，伤后12 h表达达到高峰，伤后24h表达减弱，伤后3d表达较24h增强，伤后5d再次达到高峰，随后7～10d表达逐渐减弱，并于伤后15d逐步恢复至对照组水平，呈现出双峰变化。本实验结果表明，在正常组和假手术组中仅有少量p25蛋白，损伤后p25蛋白量增加，伤后6h达到高峰，伤后12h蛋白量逐渐下降，伤后24 h降至低峰，伤后3 d蛋白量出现升高，伤后5 d时再次达到高峰，随后p25蛋白量再次下降，呈现与calpain规律一致的双峰变化。其原因可能为钝力性脑挫伤后引起缺血缺氧性脑损伤，短暂性脑缺血后钙离子通过NMDAR通道和L型电压门控钙离子通道内流，通过scr家族引起细胞内钙离子超载[16]，大量激活细胞内calpain，引起p25蛋白量升高。在本实验中，正常组和假手术组中有较多p35蛋白表达，钝力性脑挫伤后p35蛋白表达持续下降，损伤12h后降至最低，其原因可能为损伤后机体处于应激状态，大量损伤蛋白的产生引起细胞内蛋白酶体水平升高，p35降解增多，而损伤后引起的calpain活性升高，裂解p35为p25也是其表达减少的原因之一。伤后24 h组p35蛋白表达量逐渐升高，损伤5 d后基本回复至正常水平，呈现规律的单峰变化。

脑挫伤时间推断需要多指标综合分析判断，一直是法医学研究的重点和难点之一，目前仍需深入研究寻找与脑挫伤时间有良好相关性的指标。本实验在建立成熟稳定脑挫伤模型的基础上，对脑挫伤后p35及p25蛋白表达进行研究，发现其表达具有时间规律，并与相关指标的表达规律一致，可为准确推断脑挫伤时间提供更多理论依据。

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Expression of p35 and p25 after Focal Cerebral Contusion in Rat

WANG Han-zhi1,2,LI Ru-bo1,WANG Zheng-yin1,ZHANG Li-jun3
（1.Department of Forensic Pathology,College of Forensic Medicine,China Medical University,Shenyang 110001,China;2.Public Security Bureau of Suzhou,Suzhou 215000,China;3.Public Security Bureau of Diaobingshan,Diaobingshan 112700,China）

Objective To study the expression of p35 and p25 in rat after focal cerebral contusion and to provide experimental data for estimating brain injury time.Methods Fifty adult male SD rats were randomly divided into 0 h,6 h,12 h,24 h,3 d,5 d,7 d,10 d after focal cerebral contusion,control and sham-operated groups（5 rats each group）.The focal cerebral contusion rat model was established.The expression of p35 and p25 protein of the damage peripheral zone in brain were detected by HE staining,immunohistochemistry and Western blotting at different injury time.Results A large number of p35 protein and a small amount of p25 protein were expressed in control group and sham-operated group. After focal cerebral contusion,p35 presented unimodal change with time and p25 presented bimodal changes with time.Conclusion Expression of p35 and p25 showed different regularity with good time correlation,which could help to estimate the brain injury time.

forensic pathology;brain injuries;p35;p25;rats

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2015.02.004

1004-5619（2015）02-0093-04

2013-05-29）

（本文编辑：刘宁国）

辽宁省教育厅科学研究一般项目（L2013317）；辽宁省自然科学基金资助项目（2014021027）

王汉志（1986—），男，山东烟台人，硕士研究生，主要从事脑损伤时间推断研究；E-mail：hanzhi3414＠163.com

李如波，男，博士，教授，主要从事脑死亡及弥漫性脑损伤的法医病理学研究；E-mail：rbli＠mail.cmu.edu.cn