LEA蛋白特征片段及海藻糖对热敏性蛋白药物胰岛素冻干的协同保护

刘立李代禧郭柏松潘琦余华星柴培刘宝林杨春生

（1上海理工大学生物系统热科学研究所 上海 200093；2上海东富龙科技股份有限公司 上海 201108）

LEA蛋白特征片段及海藻糖对热敏性蛋白药物胰岛素冻干的协同保护

刘立1李代禧1郭柏松2潘琦1余华星1柴培1刘宝林1杨春生2

（1上海理工大学生物系统热科学研究所 上海 200093；2上海东富龙科技股份有限公司 上海 201108）

热敏性蛋白药物胰岛素的热稳定性较差，极易受制备方式和保存条件等影响而失活。故本研究分别利用高效液相色谱（HPLC）测定冻干样品中胰岛素的效价和差示扫描量热仪（DSC）测定冻干样品的玻璃化转变温度等重要参数，来研究胚胎发育晚期富集蛋白特征片段（LEA⁃motif，LEAM）和海藻糖冻干保护剂对胰岛素冻干保护效果的影响。冻干实验表明，两种保护剂均对胰岛素的活性具有保护效果，且LEAM的活性保护效果优于海藻糖。在效价和热稳定性方面，LEAM保护的胰岛素冻干品均高于海藻糖保护的胰岛素冻干样品。更为重要的是，两种保护剂协同保护时，少量海藻糖对于LEAM的保护特性具有增效作用。在冻干过程中，可有效提升药物玻璃态的稳定性，防止热致变性失活。由此可见，这种LEAM和海藻糖保护剂复合保护方法有望也可以应用在热敏性蛋白药物冻干粉针制备过程以保护药物活性。

LEA蛋白特征片段；胰岛素；海藻糖；冷冻干燥；活性保护

胰岛素（Insulin）是机体内唯一降低血糖的蛋白质激素。人体内缺乏胰岛素会导致高血糖，引发糖尿病［1］，故常用胰岛素来治疗糖尿病。胰岛素的传统给药方式为皮下注射法。此外，肺部吸入给药也是比较可行的非注射给药途径［2］。Alkenmes公司与Lilly公司联合研制了AIR系统。AIR给药装置是呼吸促发型被动装置［3］。由于吸入型胰岛素主要采用真空冷冻干燥的方式制备，为防止热敏性蛋白药物胰岛素失活，制备冻干粉剂时常加入辅料［4］（如糖类，氨基酸和脂类），但收效甚微，药品活性仍有较大损失，且储存稳定性较差。因此，迫切需要寻求一种行之有效的保护剂，在冻干过程中不仅保护胰岛素活性，而且提升药物的储存稳定性。由于含有LEA蛋白的生物能够迅速适应高温或低温导致的极度缺水环境［5－10］，故本文选取线虫中第三组 LEA蛋白中的AavLEA1蛋白的K47⁃E57的11个氨基酸的特征重复片段（LEA⁃motif，LEAM）作为保护剂［11］。

效价是生物制品活性（数量）高低的标志，可用来表征生物制品的活性。最初对胰岛素活性的测定基本采用小鼠生物活性效价检定法。由于此方法个体差异大、耗时长、操作繁琐，而高效液相色谱法操作简便、测量精密度高，故美国、英国药典近来均将高效液相色谱法测定效价纳入胰岛素的效价测定方法［12］。因此，本文选用高效液相色谱法（High per⁃formance liquid chromatograph，HPLC）测定效价，研究LEAM和海藻糖对胰岛素的协同保护作用。首先，利用HPLC测定胰岛素效价，分析不同保护剂配比对胰岛素冻干活性保护效果，再利用差示扫描量热仪（Differential scanning calorimetry，DSC）测定冻干样品的玻璃化转变温度、热焓松弛峰温和热焓松弛焓值，分析不同保护剂配比对冻干品热稳定性的影响，最终研究LEAM和海藻糖对胰岛素的协同保护机理。

1 实验材料与方法

1.1 材料和仪器

猪胰岛素标准品，批号：140720⁃200901，中国药品生物制品检定所。猪胰岛素，批号：1306A04，徐州万邦金桥制药有限公司，白色结晶性干粉，按干燥品计，每1 mg供试品的效价为28.3 IU。LEA蛋白特征重复片段，批号：LT130325，北京泽溪源生物科技有限公司，白色干粉，纯度＞95%。海藻糖（Trehalose）为二水海藻糖，批号：061027，上海源聚生物科技有限公司，纯度＞98%。盐酸（Hydrochloric acid），批号：20091102，湖南尔康制药有限公司，分析纯。无水硫酸钠（Sodium sulfate anhydrous），批号：20130830，上海润捷化学试剂有限公司，为分析纯。乙醇胺（Mo⁃noethanolamine），批号：20130228，上海润捷化学试剂有限公司，为分析纯。磷酸（Phosphoric acid），批号：20120618，江苏强盛功能化学股份有限公司，为分析纯。乙腈（Acetonitrile）为色谱纯试剂。实验用水均为二次蒸馏水。

冻干机采用LYO⁃0.2型冻干机，上海东富龙科技股份有限公司。高效液相色谱仪由Waters e2695分离模块和Waters 2998光电二极管检测器组成，美国Waters公司。差示扫描量热仪为DSC1，瑞士Mett⁃ler⁃Toledo公司。卡尔费休滴定仪采用Mettler Toledo DL38卡尔费休滴定仪，瑞士Mettler⁃Toledo公司。

1.2 实验方法

1.2.1 胰岛素保护剂溶液的配制

首先，配制成50 mL 4.2 mg／mL的猪胰岛素溶液。再分别按照胰岛素和保护剂不同的质量比，加入适量保护剂，最后分装成1 mL的溶液冻干。根据胰岛素和保护剂的相关配比依次分成四组，具体数据详见表1。实验中所用溶液均现配现用。

表1 胰岛素和保护剂配比Tab.1 The ratio of insu lin and p rotectant

1.2.2 样品的冻干

样品首先预冻至－45℃，持续1 h，一次干燥至－35℃，持续18 h，二次干燥至25℃，持续6 h，真空度为10 Pa［13］。冻干结束后，样品无塌陷。样品冻干完成后，利用卡尔费休滴定仪，测定冻干干粉的水分含量，水分含量均在3%左右。

1.2.3 HPLC测定胰岛素效价

胰岛素的效价测定利用反相色谱技术进行测定。色谱柱采用XBridge C18柱（4.6×250 mm，5 μm）；以0.2 mol／L硫酸盐缓冲液（取无水硫酸钠28.4 g，加水溶解后，加磷酸2.7 mL，乙醇胺调节pH值至2.3，加水至1000 mL）⁃乙腈（74：26）为流动相；柱温为40℃；检测波长为214 nm。每次取样20 uL，按照外标法获得效价。冻干后样品，均用等体积超纯水复溶后测定。

1.2.4 DSC测定热稳定性

温度和热熔标定采用标样铟和锌的熔融过程（均采用外推起始温度）进行两点标定。标定速率为10℃／min，液氮冷却采用Cryofab公司的液氮容器控制。样品冲洗气体为高纯度氮气（纯度＞99.999%），流量20 mL／min保持不变。样品量为5～10 mg，精确到±0.01 mg。天平采用梅特勒⁃托利多的XS205，精确到0.01 mg。样品皿为40 uL标准液体铝皿（上海笛柏实验设备有限公司），用液固通用压机（瑞士Mettler⁃Toledo公司）压制。

表2 加入不同保护剂后冻干品外观检测结果Tab.2 The appearance of lyophilized insulin with different protectant

本实验的测量温度范围为25～165℃。设定的实验程序为从25℃开始，以5℃／min的升温速率升温至165℃。玻璃化转变温度采用热分析软件STAReSoftware（瑞士 Mettler⁃Toledo公司，12.00版本）。取发生玻璃化转变的中点温度为玻璃化转变温度，取热焓松弛峰处的温度为热焓松弛峰温，取热焓松弛峰面积为热焓松弛焓值。

2 结果与讨论

2.1 冻干样品外观表征

胰岛素冻干的参照样品和第1组LEAM保护的胰岛素冻干样品的外观均为白色疏絮状，带有裂缝。而第2组海藻糖保护胰岛素冻干样品的外观具有一定差异性，当胰岛素和海藻糖的质量比在1：1和1：2时，海藻糖保护的胰岛素冻干样品内有些许裂缝，但当胰岛素和海藻糖的质量比在1：3以上时，海藻糖保护的胰岛素冻干样品内的裂缝消失，外观为白色絮状物，外形完整。同时，第3组和第4组LEAM和海藻糖协同保护的胰岛素冻干样品的裂缝较LEAM保护的胰岛素冻干样品少。因此，海藻糖在外观方面还可起赋形剂的作用。

2.2 保护剂对胰岛素冻干样品效价影响

图1为胰岛素标准品溶液的液相色谱图。图3 （c），3（e）和3（f）中的LEAM峰，胰岛素峰和A⁃21脱酰胺峰均较好分离。由于糖类的分子量较小，利用反相色谱技术不能较好捕获，因此图3（d），3（e）和3 （f）上仅有胰岛素峰、A⁃21脱酰胺胰岛素峰及LEAM峰，无海藻糖峰。所有A⁃21脱酰胺峰的峰面积所占比例均小于5%，符合药典规定标准［14］。

图1 胰岛素标准品曲线Fig.1 The HPLC curve of insulin standard solution

图2 单一及协同保护剂保护的冻干品中胰岛素效价减少量Fig.2 Proficiency decrement of lyophilized insulin w ithin only LEAM／trehalose and synergistical LEAM and trehalose

图2为冻干前后不同质量LEAM或海藻糖保护下胰岛素的效价减少量对比柱形图。发现未加任何保护剂冻干参照样品，胰岛素的效价从冻干前的46.50 IU／mL降低至冻干后的38.57 IU／mL，效价减少7.93 IU／mL，说明冻干会造成胰岛素的效价下降，易使药物失去活性。而第1组LEAM保护的冻干样品中胰岛素效价减少量约为1.69～2.25 IU／mL，且当胰岛素和LEAM的质量比1：7时，胰岛素效价减少量最小，冻干保护效果相对其他浓度的胰岛素⁃LEAM冻干品而言较优。第2组海藻糖保护的冻干样品中胰岛素效价减少量约为3.28～6.39 IU／mL，当胰岛素和海藻糖的质量比为1：5时，胰岛素效价减少量最小，冻干保护效果相对较优。

图3 胰岛素溶液及相关冻干样品的高效液相色谱图Fig.3 High performance liquid chromatography images

添加保护剂的胰岛素冻干样品效价减少量均低于未添加保护剂的胰岛素冻干样品效价减少量，说明LEAM和海藻糖均对胰岛素的冻干具有活性保护作用，能有效防止胰岛素由于冻干而引起的失活，且LEAM比海藻糖对胰岛素的冻干保护效果更好。

图2还表明了LEAM和海藻糖对胰岛素协同保护效果。第3组胰岛素样品中同时添加不同质量比的LEAM和海藻糖做冻干活性保护剂时，在相同条件下冻干，发现该冻干样品中胰岛素效价减少量仅为0.14～1.80 IU／mL，说明在LEAM中加入一定量的海藻糖后，能更好保护胰岛素的生物活性。因此，LEAM和海藻糖对冻干过程中的胰岛素起协同保护作用。当LEAM和海藻糖复合保护的冻干样品中胰岛素和海藻糖质量比为1：1时，冻干样品中胰岛素效价减少量随着LEAM加入量的增大而减小，即随着LEAM加入量的增大，冻干保护效果更优。胰岛素和LEAM的比例为1：5时，冻干保护效果达到相对最佳。

第4组复合保护的冻干样品组中的海藻糖的质量比提高1倍。冻干效价减少量表明胰岛素和LEAM质量比为1：1和1：3时的冻干样品的胰岛素效价减少量均比第3组复合保护的冻干样品效价减少量小；当胰岛素和LEAM质量比提高到1：5和1：7时，复合保护冻干样品的效价减少量又均比第3组胰岛素冻干样品的效价减少量大，但依然比前两组的保护效果好。这说明加入少量海藻糖对提升胰岛素和LEAM的协同保护效果更好。因为大量海藻糖的存在可能会影响LEAM在胰岛素蛋白表面的吸附作用，导致LEAM吸附保护作用减弱。

根据水替代假说［15］，在干燥过程中，随着水分子的缺失，高亲水性的LEAM会稳定吸附在胰岛素蛋白表面，形成保护层，保护胰岛素不因缺水而受到伤害。但因分子较大，不能完全占据整个胰岛蛋白分子表面，加入海藻糖后，小分子的海藻糖可以有效弥补这种缺陷，在胰岛素表面协同作用，有效形成一种复合保护层。当海藻糖数量较多时，胰岛蛋白表面大部分被海藻糖占据，尽管海藻糖不易结晶，而是形成玻璃态，也有保护作用［16］，但是LEAM被逐渐隔离开来，故保护效果又有明显下降。

2.3 冻干样品的DSC热分析

药物冻干后，原来的水溶剂环境消失，溶剂化稳定作用也消失，干燥的无水环境打破了蛋白质表面基团间作用力的平衡，药物活性结构的稳定性逐渐变差。而加入保护剂后，保护剂在药物蛋白表面的吸附作用，可以部分替代水溶剂环境，维持蛋白质活性结构的稳定性。为了研究不同保护剂及其配比对胰岛素蛋白的稳定作用，本文利用差示扫描量热仪，测定冻干样品的玻璃化转变温度、热焓松弛峰温和热焓松弛焓值，分析各保护剂对蛋白药物的保护效果及整体热稳定性。

图4（a）所示为胰岛素的DSC曲线、图4（b）所示为LEAM保护剂的DSC曲线、图4（c）所示为海藻糖保护剂的DSC曲线。观察图4（c）发现，海藻糖的DSC曲线，在98.47℃有一个明显的吸热峰，同时文献［17］中指出二水海藻糖的熔融温度为97℃，该吸热峰温度与文献中所列温度较一致，故本实验所用海藻糖的熔融峰的峰温为98.47℃±0.59℃。而除图4（c）外，其它样品的DSC曲线的玻璃化转变区域的高温侧均有一个吸热峰，这是由于结构松弛引起的焓恢复过程，即从高能非平衡玻璃态向平衡态松弛的过程，故胰岛素干粉和LEAM干粉发生了伴随热焓松弛的玻璃化转变。同时，进一步观察加入不同剂量配比保护剂后冻干样品的DSC曲线（图5）发现，加有保护剂的冻干样品也均发生伴随热焓松弛的玻璃化转变。

表3所示为不同保护剂含量下冻干样品的玻璃化转变温度、热焓松弛峰温和热焓值。分析表3中的数据可知，第1组实验中，当LEAM作为保护剂时，且胰岛素和LEAM的质量比为1：1时，该冻干样品的玻璃化转变温度比胰岛素干粉的玻璃化转变温度仅高出0.53℃，同时该冻干样品的热焓松弛峰温低于胰岛素干粉的热焓松弛峰温，说明单纯加入较低剂量LEAM保护剂对冻干样品热稳定性的提升影响较小，冻干样品热稳定性仍较差，较易发生分解。但随着LEAM加入量的增大，冻干样品的玻璃化转变温度和热焓松弛峰温均随着LEAM的增加而增大，说明随着LEAM的增加，冻干样品在更高温度发生相变，热稳定性得到提高。文献［18］中指出10%和20%的海藻糖溶液冻干品的玻璃化转变温度分别为35.3℃和36.6℃。而LEAM粉末的玻璃化转变温度为134.58℃，LEAM粉末的玻璃化转变温度远远高于海藻糖冻干品。因此，第1组LEAM保护的胰岛素冻干样品的玻璃化转变温度和热焓松弛峰温均高于第2组海藻糖保护的胰岛素冻干样品，说明LEAM保护效果更好，可更大程度上提升冻干样品的热稳定性。

在第3组两种保护剂复合保护胰岛素的DSC实验中，复合保护的冻干样品的玻璃化转变温度分别较第1组冻干样品提升1.31℃、0.3℃、0.09℃和8.11℃。第4组复合保护胰岛素冻干样品的玻璃化转变温度（除第4组第1个冻干样品的玻璃化转变温度降低外）分别比第1组冻干样品提升0.53℃、2.87℃和8.83℃。说明除胰岛素⁃LEAM⁃海藻糖质量比为1：1：2的冻干样品外，两种保护剂协同作用后，对冻干样品的玻璃化转变温度均有提升，即协同保护的冻干样品的热稳定性提升。

第3组和第4组冻干样品的玻璃化转变温度，均随着LEAM和海藻糖加入量的增大而增大。观察所有两组冻干样品的热焓松弛峰温，发现两种保护剂协同作用后的所有冻干样品（除胰岛素⁃LEAM⁃海藻糖质量比为1：1：2冻干样品外）的热焓松弛峰温均比第1组LEAM保护的冻干样品低。原因可能是由于海藻糖在98.47℃附近即发生熔融，故复合保护的冻干样品的热焓松弛峰温均比第1组LEAM保护的冻干样品低。

比较复合保护的冻干样品和第1组冻干样品的热焓松弛焓值，发现除胰岛素⁃LEAM⁃海藻糖质量比为1：1：2的冻干样品外，其余复合保护的冻干样品的热焓松弛焓值均低于相应的第1组冻干样品的热焓松弛焓值，且随着海藻糖的增加，冻干样品的热焓松弛焓值降低。这说明LEAM和少量海藻糖协同保护的冻干样品，较相应的LEAM保护胰岛素冻干样品而言，更难发生从玻璃态转化为结晶态的焓松弛。其原因可能是干燥诱导LEAM较好地贴合在胰岛素蛋白的外面，稳固了胰岛素蛋白的稳定性，而加入少量海藻糖后，提升了玻璃体的强度，从而提升冻干样品的热稳定性。

表3 不同保护剂含量下冻干样品的玻璃化转变温度，热焓松弛峰温和热焓松弛焓值Tab.3 Variation of Tg，Tmaxand ΔH of lyophilized products with different mass of protectant

图4 胰岛素及LEAM、海藻糖保护剂的DSC曲线Fig.4 DSC curves of insulin and protectant LEAM and trehalose

而当胰岛素、LEAM和海藻糖的质量比为1：1：2时，该冻干样品的玻璃化转变温度较单一胰岛素的玻璃化转变温度低，该样品的DSC曲线的峰型与第2组海藻糖保护的胰岛素冻干样品的DSC曲线峰型具有较高一致性，其原因可能是由于该冻干样品中海藻糖含量较高，而海藻糖冻干品具有较低的玻璃化转变温度，该体系的玻璃化转变温度较低。

3 结论

本研究分别利用高效液相色谱测定胰岛素效价和差示扫描量热仪测定冻干样品玻璃化转变温度等方法，以研究LEAM和海藻糖及其二者协同作用对热敏性蛋白药物胰岛素的冻干保护效果和热稳定性的影响。

图5 LEAM和海藻糖分别保护的冻干样品及LEAM和海藻糖协同保护冻干样品DSC曲线图Fig.5 DSC curves of lyophilized insulin⁃LEAM，insulin⁃trehalose and synergistic LEAM and trehalose with insulin products

LEAM或海藻糖均对热敏性蛋白药物胰岛素具有一定保护效果，且LEAM的保护效果优于海藻糖。LEAM保护的胰岛素冻干样品的热稳定性也高于海藻糖保护的胰岛素冻干样品。因此，LEAM是一种优良的冻干活性保护剂。

两种保护剂复合保护时，少量海藻糖对于LEAM的保护特性具有协同增效的作用，但随着海藻糖的增加，对冻干协同保护效果的提升不明显。DSC测定结果则显示，两种保护剂协同作用不仅可有效提高冻干样品的玻璃化转变温度，还提升了冻干样品的玻璃体强度，增加了冻干样品的热稳定性。

两种保护剂复合保护时，最佳的配比是胰岛素⁃LEAM⁃海藻糖质量比为1：1：2～1：3：2。

本文受上海市“创新行动计划”国际科技合作项目（12430702000），上海市重点学科项目（T0503和 P0502），上海市自然科学基金（12ZR1420400），上海市教委科研创新项目（14YZ092）和上海市联盟计划项目资助。（The project was supported by the Innovation Foundation for International Coopera⁃tion of the Shanghai Committee of Science and Technology（No. 12430702000），Key Disciplines Program of Shanghai（No.T0503 ＆No.P0502），the Natural Science Foundation of Shanghai（No. 12ZR1420400），Innovation Program of Shanghai Municipal Edu⁃cation Commission（No.14YZ092）and Alliance Program in Shanghai.）

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李代禧，男，博士，硕士生导师，副教授，上海理工大学生物系统热科学研究所，（021）55271117，E⁃mail：dxli75＠126.com。研究方向：计算生物学和低温生物热科学。现在进行的研究项目：国家自然科学基金（51076108），上海市＂创新行动计划＂国际科技合作项目（12430702000），上海市重点学科项目（T0503和P0502），上海市自然科学基金（12ZR1420400），上海市教委科研创新项目（14YZ092）和上海市联盟计划项目。

About the corresponding author

Li Daixi，male，Ph.D.，master instructor，associate professor，Institue of Biothermal Science and Technology，University of Shanghai for Science and Technology，＋86 21－55271117，E⁃mail：dxli75＠126.com.Research fields：computational biology and cryobiology thermal science.The author takes on project sup⁃ported by the National Natural Science Fundation of China（No. 51076108），the Innovation Foundation for International Coopera⁃tion of the Shanghai Committee of Science and Technology（No. 12430702000），Key Disciplines Program of Shanghai（No.T0503 ＆No.P0502），the Natural Science Foundation of Shanghai（No. 12ZR1420400），Innovation Program of Shanghai Municipal Edu⁃cation Commission（No.14YZ092）and Alliance Program in Shanghai.

Synergistic Bioactive Protection of LEA⁃motif and Trehalose on Insulin during Freeze⁃drying

Liu Li1Li Daixi1Guo Baisong2Pan Qi1Yu Huaxing1Chai Pei1Liu Baolin1Yang Chunsheng2

（1.Institute of Biothermal Science and Technology，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai，200093，China；2.Shanghai Tofflon Science and Technology Co.，Ltd.，Shanghai，201108，China）

Water Due to the poor heat stability，insulin is easy to lose its bioactivity during storage.Bioactive protection of LEA⁃motif（LEAM）and trehalose towards insulin was investigated respectively and synergistically.High performance liquid chromatography method was used to study the proficiency of insulin and differential scanning calorimetry was used to study glass transition temperature.According to the re⁃sults，both LEAM and trehalose can protect the bioactivity of insulin.The protective effect of LEAM is better than that of trehalose.That is to say that the bioactivity proficiency and heat stability of insulin within LEAM are better than those of insulin within trehalose.It is in⁃teresting that adding a bit trehalose can enhance the bioactive protection effect of LEAM towards insulin.During lyophilization，synergistic bioactive protection of LEAM and trehalose can not only enhance the stability of insulin，but also protect insulin from thermal degenera⁃tion.So such synergistic bioprotectants can be used to maintain the bioactivity of heat sensitive protein during lyophilization.

LEA⁃motif；insulin；trehalose；lyophilization；protectant

R318.52；TQ025.3

A

0253－4339（2015）04－0111－08

10.3969／j.issn.0253－4339.2015.04.111

简介

国家自然科学基金（51076108）资助项目。（The project was supported by the National Natural Science Fundation of China（No. 51076108）.）

2014年12月8日