RP-HPLC-ELSD同时测定绞股蓝中各成份含量

李浩飞

平煤神马医疗集团总医院药剂科，河南平顶山467000

RP-HPLC-ELSD同时测定绞股蓝中各成份含量

李浩飞

平煤神马医疗集团总医院药剂科，河南平顶山467000

目的用RP-HPLC-ELSD同时测定绞股蓝中人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷A、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII的含量。方法采用Phenomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，流动相为乙腈(A)-0.5%醋酸(B)，梯度洗脱（0～5min，10%A；5～27min，10%～40%A，27.1min，10%A；27.1～30min，10%A），柱温30℃，流速1.0mL/min，载气为N2，体积流量2.0 L/min，雾化温度42℃，漂移管温度65℃，增益5。结果人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷A、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII在152.4～3048 ng（r=0.9996）、65.2～1304 ng（r=0.9998）、87.2～11744 ng（r=0.9998）、11.3～226 ng（r=0.9995）范围内的线性关系良好。平均回收率分别为100.05%、100.36%、100.82%、100.61%(n=9)，RSD分别为1.77%、2.17%、2.31%、2.65%。9批绞股蓝样品含量范围：绞股蓝皂苷A 6.92～22.63 mg/g，人参皂苷Rb1 0～11.23 mg/g，绞股蓝皂苷XLIX 0～13.24 mg/g，七叶胆苷XVII 0～4.16 mg/g。结论该方法测定绞股蓝中皂苷类成分含量灵敏、准确，分离效果较好，无干扰，可为完善绞股蓝中皂苷类成分的质量标准评价提供依据。

绞股蓝；高效液相色谱法；蒸发光散射检测器

绞股蓝，又称天堂草、福音草、超人参、公罗锅底、遍地生根、七叶胆、五叶参和七叶参等，是Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino葫芦科绞股蓝属多年生草质藤本植物[1-2]。绞股蓝主要有效成份是绞股蓝皂苷、绞股蓝糖苷、水溶性氨基酸、黄酮类、多种维生素、微量元素、矿物质等[2-3]，现代药理研究表明[4-6]，绞股蓝具有保护心脑血管、抗肿瘤、增强免疫、降血糖、调血脂、保肝、抗氧化、抗溃疡以及抗衰老等活性。绞股蓝开发的力度较大，但对其全面的质量控制还不够完善。另外，目前对绞股蓝中的人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷A、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII 5种成分同时测定的报道较少。因此，该文探讨用RP-HPLC-ELSD同时测定绞股蓝中人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷A、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII的含量，旨在完善绞股蓝的综合质量评价方法。

1 仪器与试药

Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），Alltech 3300蒸发光散射检测器；YQ-1000A型超声清洗器（上海易净超声波仪器厂）；Sartorius BP211D分析天平（德国赛多利斯）；人参皂苷Rb1对照品(批号：110704-201122)，供HPLC含量测定用，由中国药品生物制品检定所提供；绞股蓝皂苷A对照品(批号：157752-0107)、绞股蓝皂苷XLIX对照品(批号：13080202)、七叶胆苷XVII对照品(批号：13050301)，由成都成都曼思特生物科技有限公司提供。乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯；水为超纯水；绞股蓝药材购自全国不同地区，经该院药学部鉴定为葫芦科植物绞股蓝Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino的干燥全草。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

取绞股蓝皂苷A、人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII对照品适量，精密称定，分别置5mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得单个对照品储备液，浓度分别为1.524mg/mL、1.304mg/mL、0.872mg/mL、0.565 mg/mL。精密量取各对照品溶液量瓶中，甲醇稀释并定容，制成混合对照品溶液，浓度分别为：绞股蓝皂苷A 152.4μg/mL、人参皂苷Rb165.2 μg/mL、绞股蓝皂苷XLIX 87.2 μg/mL、七叶胆苷XVII 11.3 μg/mL，即得。

2.2 供试品溶液的制备

取绞股蓝粉末（过3号筛）0.1 g，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇25mL，超声处理（功率250 W，80 kHz）30min，过滤，滤液挥干，加水溶解，用水饱和正丁醇萃取至无色，合并萃取液，用氨试液洗涤2次，弃氨试液，减压蒸干，用甲醇定容至10mL，摇匀，用0.45 μm滤膜过滤，即得。

2.3 色谱条件

Phenomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，流动相：乙腈(A)-0.5%醋酸水(B)，梯度洗脱（0～5min，10% A；5～27min，10%～40%A，27.1min，10%A；27.1～30min，10%A），柱温30℃，流速1.0mL/min，载气为N2，体积流量2.0 L/min，雾化温度42℃，漂移管温度65℃，增益5。理论塔板数按绞股蓝皂苷A峰计算不低于2000，见图1。

图1 混合对照品溶液（A）和供试品溶液（B）高效液相色谱图

2.4 线性关系试验

精密吸取上述混合对照品溶液1μL、5μL、10μL、15μL、20μL，注入色谱仪，以进样量的对数为自变量，色谱峰面积的对数为因变量，绘制标准曲线，建立回归方程，绞股蓝皂苷A、人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII在较大范围内线性关系良好，见表1。

表1 线性回归性分析

2.5 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液10μL，以各峰面积的对数分别计算，结果：绞股蓝皂苷A、人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII的RSD分别为1.64%、2.37%、2.36%、2.61%（n=5）。

2.6 稳定性试验

精密吸取新制备的同一供试品溶液（浙江永嘉），于0、2、4、6、8、10、12 h进样10μL进行含量测定，计算RSD值。结果显示，绞股蓝皂苷A、人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII的含量分别为7.11mg/g、2.89 mg/g、2.41 mg/g、1.64 mg/g，RSD分别为1.76%、2.13%、2.45%、2.33%，结果表明样品在12 h之内稳定性较好。

2.7 重复性试验

取同一批样品（浙江永嘉），共6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，进样体积10μL，以对数外标两点法计算含量，绞股蓝皂苷A、人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII的含量分别为7.02 mg/g、3.12 mg/g、2.48 mg/g、1.56mg/g，RSD分别为1.97%、2.25%、2.51%、2.14%（n=6）。

2.8 加样回收率试验

取已经测定含量的样品（浙江永嘉）9份，每份约0.05 g，精密称定，按照供试品测定的绞股蓝皂苷A、人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII含量，以其一半的100%比例精密加入单个储备对照品溶液，再按照2.2项下方法制备供试品溶液，并按色谱条件测定样品，计算回收率，结果：绞股蓝皂苷A、人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII的回收率分别为100.05%、100.36%、100.82%、100.61%（n=9），见表2。

2.9 样品含量测定

取所收集的9个不同来源绞股蓝药材，按照上述色谱条件下进样测定，以对数外标两点法计算绞股蓝中成分的含量见表3。

表3 不同产地样品测定结果[n=3，（mg/g）]

3 讨论

绞股蓝号称“南方人参”，在中国主要分布在陕西平利、甘肃康县、湖南、湖北，云南、广西等省，民间称其为神奇的“不老长寿药草”，1986年，国家科委在“星火计划”中，把绞股蓝列为待开发的“名贵中药材”之首位，2002年国家卫生部将其列入保健品名单[7]。绞股蓝具有减肥、降血脂、调血压、延缓衰老、预防冠心病、抑制癌细胞、调节人体生理机能、增强机体免疫力等功能，绞股蓝皂苷是其主要药效成分[8-10]。人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷A、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII均为绞股蓝中的皂苷类成分，文献报道采用紫外检测器测定绞股蓝中的皂苷类成分，检测波长在203 nm[11-13]；单一对某一绞股蓝中的皂苷类成分进行测定，对多种绞股蓝中的皂苷类成分同时测定较少。该实验采用反相高效液相色谱法，结合蒸发光散射检测器，建立了绞股蓝中人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷A、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII的测定方法，通过方法学考察，结果显示该方法快速、结果准确可靠，可作为绞股蓝中人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷A、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII的质量控制方法

该实验在流动相系统的考察中，对比乙腈-水、甲醇-水、乙腈-甲醇-水等流动性系统，结果显示乙腈-水系统效果较为理想，分离效果俱佳，且加入0.5%醋酸的乙腈-水系统后，峰形对称性较好，对称因子均在0.95～1.05之间，能完成对人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷A、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII的分离。因此，选择乙腈-0.5%醋酸系统作为流动相。该文采用梯度洗脱，梯度变化比例简单，克服了梯度过于复杂，难以操作，避免梯度复杂而导致重复性较低和基线不稳等现象出现，最终造成的是样品组分含量难以得到保证。而该文中各峰均能达到基线分离，能较好对4种成分的定性和定量。该文采用蒸发光散射检测器作为检测器，由于这4种皂苷类成分紫外最大吸收波长为203 nm左右，属于吸收末端，采用紫外检测器检测，物质相互间干扰较大，分离效果较差，而蒸发光散射检测器可以避免这类情况发生。

在对不同产地绞股蓝中人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷A、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII的含量比较，结果显示，绞股蓝皂苷A 6.92～22.63 mg/g，人参皂苷Rb10～11.23 mg/g，绞股蓝皂苷XLIX 0～13.24 mg/g，七叶胆苷XVII 0～4.16 mg/g，绞股蓝中的人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷A、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII成分差异较大，这可能与产地的气候、水土等环境因素有关，这不仅表现在成分种类差异，也表现在成分含量差异。

表2 加样回收率试验结果

综上所述，该文建立了RP-HPLC-ELSD同时测定绞股蓝中人参皂苷Rb1、绞股蓝皂苷A、绞股蓝皂苷XLIX、七叶胆苷XVII的含量的方法，该方法测定绞股蓝中皂苷类成分含量灵敏、准确，分离效果较好，无干扰，可作为完善绞股蓝中皂苷类成分的质量标准评价提供依据。

[1]Wu YC,Zhong ZG,Liu SL,et al.Protective effect of serum containing n-butanol fraction from Gynostemma pentaphyllum on NG108-15 cell apoptosis induced by Aβ25.35 protein[J]. Zhong Yao Cai,2014,37(6):1029-33.

[2]欧阳辉,田启建,余佶,等.酶法辅助提取绞股蓝中总黄酮工艺优化[J].中草药,2011,42(5):886-889.

[3]许泽龙,杨丰庆,夏之宁.绞股蓝化学成分研究[J].天然产物研究与开发,2013,25(8):1067-1069.

[4]史琳,赵红,张璐雅,等.绞股蓝药理作用的研究进展[J].药物评价研究,2011(2):125-129.

[5]李杰,杨舟,詹琤琤.绞股蓝化学成分与药理作用研究概况[J].湖北中医杂志,2012,34(10):74-76.

[6]朱广东.中药绞股蓝的活性研究进展[J].科技创新与应用,2012(5):5.

[7]朴香兰,吴倩.绞股蓝研究进展[J].时珍国医国药,2010,21(7): 1758-1760.

[8]Tsui KC,Chiang TH,Wang JS,et al.Flavonoids from Gynostemma pentaphyllum exhibit differential induction of cell cycle arrestin H460 and A549 cancer cells[J]. Molecules,2014,19(11):17663-17681.

[9]Wu Q,Jang M,Piao XL.Determination by UPLC-MS of four dammarane-type saponins from heat-processed Gynostemma pentaphyllum[J].Biosci Biotechnol Biochem,2014,78(2):311-316.

[10]Lin-Na S,Yong-Xiu S.Effects of polysaccharides from Gynostemma pentaphyllum(Thunb.),Makino on physical fatigue[J].Afr J Tradit Complement Altern Med,2014,11(3): 112-7.

[11]史美荣，李华，白鸽，等.HPLC法测定绞股蓝中5种皂苷成分的含量[J].食品工业科技,2015,36(2):49-51,56.

[12]陈英.HPLC法测定绞股蓝中人参皂苷Rb1的含量[J].海峡药学,2013,25(9):84-86.

[13]张转平,王新权,胥道宝,等.HPLC法测定绞股蓝中绞股蓝皂苷A的含量[J].西北药学杂志,2008(2):87-88.

Simultaneous Determination of Various Ingredients Content in Gynostemma Pentaphyllum RP-HPLC-ELSD

LI Hao-fei
Department of Pharmacy，God horse general hospital medical treatment group，Pingdingshan，Henan Province,467000 China

Objective AIM To establish the method for Simultaneous determination of Gypenoside A,Ginsenoside Rb1, Gypenoside XLIX，Gypenoside XVII in Gynostemma pentaphyllum by RP-HPLC-ELSD.Methods An Phenomenex C18 column(4.6 mm×250 mm,5 μm)was used with the mixture of acetonitrile-0.5%acetic acid as the mobile phase in gradient elution（0～5min,10%A;5～27min,10%～40%A;27.1min,10%A;27.1～30min,10%A）.The flow rate was 1.0mL/min. The column temperature was 30℃.Carrier gas was nitrogen with the volume flow rate for 2.0min/L,atomization temperature was 42℃,drift tube temperature was 65℃,gain was 5.Results The calibration curves of Gypenoside A,Ginsenoside Rb1, Gypenoside XLIX,Gypenoside XVII wre in good linearity over the ranges of 152.4～3048 ng（r=0.9996）,65.2～1304 ng（r=0.9998）, 87.2～11744 ng（r=0.9998）,11.3～226 ng（r=0.9995）,respectively.the average recoveries were 98.65%（RSD of 1.95%），99.33%（RSD of 1.72%），99.67%（RSD of 2.28%），100.06%（RSD of 1.98%）,respectively.content range of 9 group of gynostemma sample were that Gypenoside A for 6.92～22.63 mg/g，Ginsenoside Rb1 for 0～11.23 mg/g，Gypenoside XLIX for 0～13.24 mg/g，Gypenoside XVII for 0～4.16 mg/g.Conclusion The method to determine Saponin compounds in Gynostemma pentaphyllum is sensitive,accurate,separation effect is good,It has no interference,it can provide a basis as evaluation standard for quality of Gynostemma pentaphyllum.

Gynostemma pentaphyllum;HPLC;ELSD

R282.71

A

1672-5654（2015）05（c）-0005-05

2015-03-02）

李浩飞（1977.12-），男，河南鲁山人，本科，副主任药师，研究方向：临床药学。