通过CHD基因鉴定信鸽性别

吕夕超，叶超，纪丝保，周阳强，李昂

（福建农林大学动物科学学院，福建福州350002）

通过CHD基因鉴定信鸽性别

吕夕超，叶超，纪丝保，周阳强，李昂*

（福建农林大学动物科学学院，福建福州350002）

本试验采用羽毛样本成功提取了信鸽基因组DNA，然后利用引物对2550F/2718R对其基因的特异性片段进行扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，雌性信鸽有2条带，分别在400 bp与600 bp左右，雄性仅有1条带，在400 bp左右。而后利用此方法，对600只性别未知的信鸽进行了性别鉴定，其中雄性信鸽358只，雌性信鸽242只，准确率达到100%，结果表明：本试验的分子生物学方法可用于鉴别信鸽性别，提高养殖经济效益，在生产管理上有广阔的应用前景。

信鸽；性别鉴定基因；PCR技术

信鸽是一种单态性鸟,是典型的“一夫一妻制”,不利于产业化饲养管理与繁殖育种。近年来,随着养鸽业的迅猛发展,国内外学者也热衷于养鸽的研究,但在分子领域的研究很少,又主要集中在肉鸽性别鉴定,关于信鸽性别鉴定的研究更是空白。利用分子手段对信鸽进行性别鉴定,与其他方法相比如翻肛鉴别、腹腔镜检、粪便类固醇检测以及核型分析,具有准确性高、简便、成本低、对动物伤害较小等优点［3］,并对降低饲养成本、提高经济效益、推动信鸽产业化具有十分重要的意义。

本试验采用羽毛样本提取信鸽基因组DNA,利用引物对2550F/2718R扩增基因的特异性片段,以鉴定信鸽性别,达到淘汰非目的性别,降低饲养成本,提高经济效益的目的。

1 材料与方法

1.1 试验材料的采集试验动物为福建闽侯旗翔生态农业有限公司培育的信鸽。选取已配对成功的30只雄性与30只雌性信鸽,每只拔取翅膀或尾部带有毛囊的新生羽毛5根,用于确定信鸽性别鉴定方法的可靠性。另随机选择600只28日龄性别未知的健康信鸽,同样每只拔取翅膀或尾部带有毛囊的新生羽毛5根,用于鉴别其性别。

1.2 试验方法

1.2.1 信鸽羽毛基因组DNA的提取每只试验鸽拔取翅膀或尾部带毛囊的新生羽毛5根,剪下羽毛根部约1 cm；用70%乙醇浸洗,蒸馏水冲洗,室温下干燥；用剪刀尽量将带毛囊的毛根剪碎；将剪碎的羽毛放入研钵中,加入液氮迅速研碎；将研碎的羽毛移入离心管中,加入DTT 10 μL、1×SET 450 μL、20 mg/mL蛋白酶K 20 μL、10%SDS 50 μL；颠倒混匀,56℃水浴振荡过夜；等体积的饱合酚和氯仿各抽提2次, 12 000 r/min离心10 min,小心吸取上层粘稠水相移至另一离心管中；加入等体积酚、氯仿、异戊醇(24∶23∶1)混合液,上、下颠倒混匀10 min,12 000 r/min离心12 min,吸取上层粘稠水相移至另一离心管中；加入1/5体积3 mol/L醋酸钠与2倍体积预冷的无水乙醇,横向剧烈振荡3 min,10 000 r/min离心10 min,管底可见白色DNA沉淀；加入70%乙醇1 mL洗涤DNA,8 000 r/min离心5 min,倒掉乙醇,将离心管倒置于滤纸上,挥发残留乙醇；加30～50 μL TE溶液溶解DNA,4℃冰箱保存备用。

1.2.2 DNA的浓度测定和质量检测信鸽基因组DNA提取完成后,使用紫外分光光度计测定DNA的浓度,并记录OD260/OD280比值。同时,采用2%琼脂糖凝胶电泳进一步检测提取的信鸽基因组DNA片段大小。

1.2.3 引物的设计与合成根据Griffiths等［1］与Fridolfsson等［2］的研究成果,选择利用以下2对引物分别对鸽子性别基因进行特异性扩增,引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

引物对1：2550 F：5′-GTTACTGATTCGTCTACGAGA-3′2718 R：5′-ATTGAAATGATCCAGTGCTTG-3′

引物对2：P2 F：5′-TCTGCATCGCTAAATCCTTT-3′P8 R：5′-CTCCCAAGGATGATRAAYTG-3′

1.2.4 PCR扩增反应体系为20 μL体系：模板1 μL,上、下游引物各0.5 μL,Mix 10 μL,灭菌去离子水8 μL。反应程序:94.0℃5 min,94.0℃30 s, 51.0℃45 s,72.0℃45 s,39个循环,72.0℃8 min,4℃保存。

1.2.5 PCR产物检测吸取5 μL PCR扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测,凝胶成像系统检测电泳结果,并拍照记录。

2 结果

2.1 信鸽基因组提取结果

2.1.1 DNA浓度与纯度紫外分光光度检测用紫外分光光度计对信鸽基因组DNA样品的浓度和纯度进行了检测,OD260/OD280结果介于1.8～2.0,说明提取的信鸽基因组DNA的纯度较高,可用于PCR扩增。

2.1.2 DNA质量的琼脂糖凝胶电泳检测将所提取的信鸽基因组DNA用2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。如图1所示,所有基因组DNA均呈现致密亮带,没有发生降解,表明所提DNA质量很好,可用于PCR扩增。

图1 DNA质量的琼脂糖凝胶电泳结果

2.2 雄性与雌性信鸽PCR扩增结果信鸽基因组DNA用2550F/2718R引物对进行PCR扩增后,扩增产物的聚丙烯酸胺凝胶电泳结果见下图2。

由图2可看到,信鸽的基因组DNA用2550F/2718R引物对进行PCR扩增后,雄性PCR产物有1条亮带,片段长约400 bp左右,而雌性PCR产物有2条亮带,1条片段长约600 bp左右,另1条片段长与雄性条带一样,约400 bp左右。

图2 雌性与雄性信鸽的PCR扩增结果

而信鸽的基因组DNA用P2F/P8R引物对进行PCR扩增后,扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果未能区分出信鸽性别。因此,在后续试验PCR扩增时,均利用2550F/2718R引物对扩增性别未知的信鸽基因组DNA。

2.3 性别未知的信鸽PCR扩增结果用上述方法对600只随机选择、性别未知的信鸽提取基因组DNA,而后用2550F/2718R引物对进行PCR扩增,扩增产物直接用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定(图3)。

图3 性别未知的信鸽PCR扩增结果

由图3可以看出,1、4、7、8、9、10泳道有2条亮带,片段长分别约400 bp左右与600 bp左右,鉴定为雌性,2、3、5、6泳道有1条亮带,片段长约400 bp左右,则鉴定为雄性。

3 讨论

3.1 信鸽羽毛样本提取DNA进行分子生物学试验一般需要提取动物基因组DNA,而试验中最为普遍的是从动物血液或组织中提取基因组DNA,这样或多或少会对动物造成应激,产生伤害。现在很多学者通过动物毛发、粪便等样品提取DNA,对取样动物基本无伤害,并解决了小动物因个体小、血管细而采血困难等问题,简省了采血器具、消毒及抗凝等试剂,得到越来越多的认可。国内外有很多用羽毛提取动物基因组DNA的报道。Horvath等［4］和Leeton等［5］均从博物馆标本的羽毛凝块中成功提取到DNA,可用于进行遗传分析。Bello等［6］报道了一种快速准确的提取方法,可从120个品种的800多种鸟类羽毛中提取到高质量的基因组。胡飞等［7］用2根次级飞羽成功提取出基因组DNA,进行PCR扩增后,利用EE0.6基因有效鉴定了焦冠鹤的性别；Alipanah等［8］从非洲鸵鸟的羽毛中顺利提取到基因组DNA,经1%的琼脂糖凝胶电泳检测认为质量较高。盖玉林等［9］利用羽毛提取DNA,采用PCR的方法,确立了画眉鸟和红嘴相思鸟的快速性别鉴定体系。

本试验结果显示,用羽毛提取基因组DNA完全可以满足鸽子性别鉴定及其他分子生物学研究的要求,进行后续试验分析。但采样时需要注意的是,应拔取翅膀或尾部新生的羽毛,且必须带有毛囊,这样提取的DNA量大、质量较高。为保证DNA的提取效果,并尽量减少对试验鸽子的应激,可选择在鸽子秋冬换羽时期拔取羽毛,2～3根便可得到PCR扩增需要的模板量。因羽毛外部都包被着角质层,性质稳定,难以裂解。在提取DNA时,需要加入二硫苏糖醇(DTT)或巯基乙醇以破坏角质层中的二硫键,有利于羽毛样品的消化裂解。为了获得量大质优的DNA,本试验拔取了5根带毛囊的新生羽毛,以保证试验结果的准确性。

3.2 利用CHD基因鉴定信鸽性别CHD基因被Griffiths等［1］发现,其进化速率慢,对于鸟类非常保守,随后此基因被广泛用于非平胸类鸟类性别分子鉴定。至今,许多学者都应用CHD基因成功地对非平胸鸟类性别进行鉴定,过程简单,结果可靠。Griffiths等［10-11］分别设计并利用P2/P3与P2/P8引物对准确鉴定出了约30种鸟类的性别；Sacchi等［12］利用P2/P8引物对扩增了短趾雕(Circaetus gallicus)的CHD基因并进行了酶切,对其性别进行了准确鉴定；Cerit等［13］通过特异性扩增CHD基因,并分析扩增结果,成功对鸡尾鹦鹉(Nymphicus hollandicus)进行了性别鉴定。陈宇科等［14］通过采用PCR方法,选定特殊的性别CHD1基因及鉴定引物,克隆出雏鸽特定性别基因序列鉴定雏鸽的雌雄。陈蓉等［15］利用引物(2550F/2718R)对美洲红鹮和火烈鸟的CHD基因进行PCR扩增,快速准确地鉴定出这两种鸟类的性别。

本研究利用P2/P8引物对和2550F/2718R引物对分别对性别已知的雌雄信鸽基因组DNA的CHD基因进行PCR扩增,结果显示2550F/2718R引物对的扩增结果更加稳定,重复性高,并且扩增产物片段较小,小片段在PCR反应中更占优势,可提高性别鉴定的精确程度,这与胡飞等［7］的研究结果一致。因此在鉴别未知性别信鸽时,全部利用2550F/2718R引物对对CHD基因进行PCR扩增。2550F/2718R引物对的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测显示,雌性有2条带,分别在400 bp与600 bp左右,雄性只有1条带,在400 bp左右,研究结果与田秀华等［16］对7种鹤形目鸟类的性别鉴定结果及刘铸等［17］对东方白鹳性别鉴定的结果一致。

4 结论

本试验采用羽毛样本提取信鸽基因组DNA,利用引物对2550F/2718R对其CHD基因的特异性片段进行扩增,结果表现出的性别差异可作为信鸽性别鉴定的依据。而后利用此方法,对600只性别未知的信鸽进行了性别鉴定,其中雄性信鸽358只,雌性信鸽242只,准确率达到100%,证明本试验的分子生物学方法有利于快速、准确、大量检测鉴定信鸽雌雄,从而便于信鸽规模化饲养管理,提高养殖经济效益,在生产管理上有广阔的应用前景。

［1］Griffiths R,Tiwari B.Sex of the last wild Spix's macaw［J］. Nature,1995,375（6531）:454.

［2］Fridolfsson A K,Ellegren H.A simple and universal method for molecular sexing of non-ratite birds［J］.J Avian Biol,1999116-121.

［3］Cerit H,Avanus K.鸟类性别鉴别方法的研究进展［J］.中国家禽,2008,30（18）:30-33.

［4］Horváth M B,Martínez-Cruz B,Negro J J,et al.An overlookedDNA source for non-invasive genetic analysis in birds［J］.J Avian Biol,2005,36（1）:84-88.

［5］Leeton P.Feathers from museum bird skins-a good source of DNA for phylogenetic studies［J］.Condor,1993,95:465-466.

［6］Bello N,Francino O,Sánchez A.Isolation of genomic DNA from feathers［J］.J Vet Diagnos Investigat,2001,13（2）:162-164.

［7］胡飞,张红霞,包文斌,等.黑冠鹤性别的分子鉴定方法［J］.中国畜牧兽医,2008,34（11）:61-63.

［8］Alipanah M.Sex determination of Ostrich（struthio camelus）using DNA markers［J］.Can J Anim SCi,2010,90（3）:357-360.

［9］盖玉林,路迪,周材权.两种观赏鸟性别的快速鉴定研究［J］.西华师范大学学报（自然科学版）,2014,35（2）:166-171.

［10］Griffiths R,Daan S,Dijkstra C.Sex identitication in biirds using two CHD genes［J］.Proc Biol Sci,1996,263（1374）:1251-1256.

［11］Griffiths R,Double M C,Orr K,et al.A DNA test to sex most birds［J］.Mol Ecol 1998,7（8）:1071-1075.

［12］Sacchi P,Soglia D,Maione S,et al.A non-invasive test for sex identification in Short-toed Eagle（Circaetus gallicus）［J］.Mol Cell Probes,2004,18（3）:193-196.

［13］Cerit H,Avanus K.Sex determination by CHDW and CHDZ genes of avian sex chromosomes in Nymphicus hollandicus［J］. Turkish J Veterinary Anim Sci,2007,31（6）:100-103.

［14］陈宇科,林海,赵苗苗,等.PCR法鉴定雏鸽性别的初步研究［J］.经济动物学报,2013,17（4）:203-206.

［15］陈蓉,陈楠,章小小,等.美洲红鹮和火烈鸟性别的分子鉴定［J］.畜牧与兽医,2014,36（1）:60-62.

［16］田秀华,刘铸,阿相宝,等.7种鹤形目鸟类性别的分子鉴定［J］.动物学杂志,2006,41（5）:62-67.

［17］刘铸,田秀华,白素英.一种准确简便的东方白鹤性别分子鉴定方法［J］.野生动物,2006,27（3）:50-53.

Sex Identification of Pigeon by Detecting CHD Gene

LV Xi-chao,YE Chao,JI Si-bao,ZHOU Yang-qiang,LI Ang*
（Department of Animal Science,Fujian Agriculture And Forestry University,Fujian Fuzhou 350002,China）

The primer pairs（2550F/2718R）was desgned and polymerase chain reaction（PCR）technique to amplificate the segments of CHD gene to identificate pigeon's sex using a DNA sample which was extracted from feather pulps. Results showed that a DNA fragment（about 400 bp）was amplified from male pigeons,and two DNA fragments（about 400 bp and 600 bp）were amplified from the female.Then 600 unknown sex samples were successfully identified by this PCR technique（358 females and 242 males）.This technique is useful in the economic and the management of pigeon production.

pigeon；sex determination；CHD gene；PCR technique

S836.2

A

0258-7033（2015）09-0012-04

2014-10-29；

2014-12-05

信鸽产业化开发利用（k08112002A）

吕夕超（1986-），男，陕西西安人，硕士，E-mail：lvxichao1986@163.com

*通讯作者：李昂（1964-），男，教授，E-mail：poul@fafu.edu.cn