松茸浓缩口服液制备过程中醇溶性物质的提取研究*

么宏伟，佟立君，付婷婷**，谢晨阳，吴洪军，赵凤臣，冯 磊，张学义

（1.黑龙江省林副特产研究所黑龙江省非木质林产品研发重点实验室，黑龙江 牡丹江 157011；2.黑龙江省林业科学院，黑龙江 哈尔滨 150081）

〈贮运加工〉

松茸浓缩口服液制备过程中醇溶性物质的提取研究*

么宏伟1，佟立君2，付婷婷1**，谢晨阳1，吴洪军1，赵凤臣1，冯 磊2，张学义1

（1.黑龙江省林副特产研究所黑龙江省非木质林产品研发重点实验室，黑龙江 牡丹江 157011；2.黑龙江省林业科学院，黑龙江 哈尔滨 150081）

本实验是松茸口服液制备醇溶性物质提取部分。将超声波辅助水提取和弱碱盐溶液提取后的残渣用乙醇溶液提取，以多酚和三萜的总提取率为检测指标，对提取的条件进行了探讨。研究表明，提取的最优工艺为乙醇浓度80%，提取时间30 min，提取温度70℃，在此条件下多酚和三萜的得率分别为1.16 mg/100g和0.23 g/100g。

松茸；多酚；三萜

松茸Tricholoma matsutake(S.Ito et Imai)Sing.，又名松口蘑，与温带和寒温带的松林与栎林共生生长，为共生菌[1]。野生松茸的生长环境极为苛刻，需要依赖柏树、橡树等阔叶林为其生长发育提供营养支持，才能形成健康的子实体[2-3]。松茸含有丰富的氨基酸、维生素、脂肪膳食纤维和多种活性酶，另含有3种珍贵的活性物质，分别是双链松茸多糖、松茸多肽和松茸醇[4-5]。松茸具很多保健功能，如提高免疫力、抗癌抗肿瘤、治疗糖尿病及心血管疾病、抗衰老养颜和促肠胃保肝脏等[6-8]。本课题以新鲜松茸为原料，利用超声波辅助水提、弱碱盐溶液提取和醇溶液提取三步提取法提取松茸中的营养物质，并制备成了松茸浓缩口服液。本试验打破了松茸在传统口服液中利用率低的局限性，通过改变提取方式，增加了松茸浓缩液的提取率，并结合口服液具有使用简单、方便，便于保藏等优势，大大提高了松茸的利用价值与经济效益。其中采用醇提取法提取松茸中的多酚及三萜。在实验中对乙醇浓度、提取时间、提取温度三个因素进行正交试验和分析，确定最佳工艺。

1 材料与方法

1.1试验材料

试验所需松茸来自黑龙江省牡丹江市东宁县。

1.2试验试剂

柠檬酸、正丁醇、肉豆蔻酯、EDTA、柠檬酸钠、纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶、碳酸钠、氯化钠、95%乙醇、葡萄糖、浓硫酸、苯酚、草酸、维生素C、偏磷酸、醋酸、氯酸铵、芦丁、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250、磷酸、没食子酸、福林酚、熊果酸、香草醛、冰醋酸、高氯酸等试剂均为国产分析纯。

1.3试验仪器与设备

主要试验仪器见表1。

表1 主要试验仪器Tab.1 Main laboratory apparatus

1.4试验方法

1.4.1 原材料预处理

选择新鲜、无病残、无虫蛀的松茸，于清水中洗净，沥水。将松茸子实体进行切片处理，用电子天平称重，加入20倍体积无菌蒸馏水，将切片后的松茸减压浸渍在含有0.03%的柠檬酸、0.02%正丁醇与0.02%肉豆蔻酯的混合溶液中，减压浸渍10 min。加入0.02%EDTA、0.2%柠檬酸钠，用组织捣碎器将组织破坏。加入纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶，按6.8 g·L-1加入，3种酶的比例为1∶1∶1.4。

1.4.2 醇溶液提取工艺的优化

（1）醇溶液提取工艺的优化

为得到松茸中的醇溶性成分，将超声波辅助水提取和弱碱盐溶液提取后的残渣用乙醇溶液提取，以多酚和三萜的总提取率为检测指标。

以多酚和三萜的总提取率为检测指标，称取超声波辅助水提取和弱碱盐溶液提取后的残渣50 g，分别改变提取条件（乙醇浓度、提取时间和提取温度）的三个因素，考察各因素对总提取率的影响，各因素水平设置如下：

乙醇浓度：50%、60%、70%、80%、90%；提取时间：30 min、60 min、90 min、120 min、150 min；提取温度：50℃、60℃、70℃、80℃、90℃。

在上述单因素实验的基础上，运用L9（33）正交表，由乙醇浓度、提取时间、提取温度作正交表，因素水平表如表2。

表2 醇溶液提取工艺的正交试验Tab.2 Orthogonal experiment design of alcohol solution extraction

（2） 醇溶液物质总得率的计算

多酚标准曲线的绘制：精确称取没食子酸标准品25 mg，用水溶解并定容至250 mL，得到0.1 mg·mL-1的标准溶液。精密吸取标准溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL于 100 mL容量瓶中，加入1 mL福林酚显色剂，摇匀后再加入2 mL15%碳酸钠溶液，定容至100 mL，室温下反应2 h后于760 nm处测吸光值，以没食子酸浓度（μg·mL-1） 为横坐标，以吸光值（OD760） 为纵坐标，如图1所示。

图1 多酚标准曲线Fig.1 Polyphenols standard curve

多酚得率的计算：取1 mL提取液，按照上述标准曲线方法测定吸光值，根据标准曲线求出提取液中多酚的浓度，可计算多酚得率（P），公式为：

P=M1/M0×100%

式中：M1表示提取液中多酚质量；M0表示松茸质量。

三萜标准曲线的绘制：精确称取熊果酸标准品1.150 mg，溶于10 mL无水乙醇中，得0.115 μg·mL-1标准溶液。精确吸取0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL标准溶液于10 mL试管中，水浴蒸干溶剂。分别向每支试管中加入5%香草醛-冰醋酸0.5 mL、高氯酸1 mL，密封。60℃水浴加热15 min，取出置于冰水中冷却。再向每支试管中加入5 mL冰醋酸溶液，摇匀。于548 nm处测吸光值，以熊果酸质量（μg）为横坐标，以吸光值（OD548）为纵坐标，如图2所示。

图2 三萜标准曲线Fig.2 Triterpenoids standard curve

三萜得率的计算：取1 mL提取液，按照上述标准曲线方法测定吸光值，根据标准曲线求出提取液中多糖的浓度，可计算三萜得率（P1），公式为：

P1=M2/M0×100%

式中：M2表示提取液中三萜质量；M0表示松茸质量。

2 结果与分析

2.1醇溶液提取最佳工艺的确定

2.1.1 乙醇浓度对醇溶性成分总得率的影响

在一定范围内，随着乙醇浓度的增加，醇溶性物质的得率也呈上升趋势，说明乙醇浓度可以改变醇溶性物质的得率。结果如图3所示。

图3 乙醇浓度对醇溶性物质总得率的影响Fig.3 The effect of ethanol concentration on the rate of alcoholsoluble substances gotta

由图3可知，醇溶性成分的总得率在乙醇浓度为80%时达到最大。乙醇浓度小时，松茸中的醇溶性物质并没有完全溶解到溶液中；而乙醇浓度大时可能会导致醇溶性成分结构破坏或物质变性影响得率。所以，以乙醇浓度80%为宜。

2.1.2 提取时间对醇溶性成分总得率的影响

提取时间会对醇溶性物质的得率产生影响，提取时间过长，会导致得率降低。结果如图4所示。

图4 提取时间对醇溶性物质总得率的影响Fig.4 Extraction time on the overall yield of the alcohol-soluble substances

由图4可知，醇溶性成分的总得率在提取时间为60 min时达到最大。提取时间少时，不能将松茸中的醇溶性物质完全提取出来；而提取时间多时可能会导致醇溶性成分结构破坏影响得率。所以，以提取时间60 min为宜。

2.1.3 提取温度对醇溶性成分总得率的影响

温度可能会对醇溶液提取过程中乙醇的挥发及醇溶性物质的结构产生影响，结果如图5所示。

图5 提取温度对醇溶性物质总得率的影响Fig.5 Effect of temperature on the extraction of alcohol-soluble substances gotta rate

由图5可知，随着提取温度的变化，醇溶性成分的总得率变化不大，在70℃时达到最大。所以，以提取温度70℃为宜。

2.1.4 醇溶液提取工艺正交试验

醇溶液提取总提取率正交设计试验因素水平表及方差分析表见表3、表4。

表3 醇溶液提取总提取率正交设计试验因素水平表Tab.3 Alcohol solution to extract total extraction rate orthogonal design factor level

表4 醇溶液提取总提取率方差分析表Tab.4 Alcohol solution to extract total extraction rate analysis ofvariance table

通过极差分析，得到因素显著性主次顺序为提取时间＞提取温度＞乙醇浓度。比较试验结果可以得出三因素的最佳组成为：乙醇浓度80%，提取时间30 min，提取温度70℃。表4的方差分析结果表明，提取时间对乙醇溶液提取的影响达到显著水平（p＜0.05）。

在最佳工艺条件下测得乙醇提取液中多酚和三萜的得率分别为1.16 mg/100g和0.23 g/100g。

醇溶液提取的最佳工艺为：乙醇浓度80%，提取时间30 min，提取温度70℃。

3 小结

松茸中的醇溶性成分（多酚和三萜）最佳提取工艺为乙醇浓度80%，提取时间30 min，提取温度70℃，此时多酚和三萜的得率分别为1.16 mg/100g和0.23 g/100g。

[1]Byeon SE,Lee J,Lee E,et al.Functional activation of macrophages,monocytes and splenic lymphocytes by polysaccharide fraction from Tricholoma matsutake[J].Archives of Pharmacal Research,2009,32(11):1565-1572.

[2]Ding X,Tang J,Cao M,et al.Structure elucidation and antioxidant activity of a novel polysaccharide isolated from Tricholoma matsutake [J].International Journal of Biological Macromolecules,2010,47(2):271-275.

[3]Kim SS,Lee JS.Process development formycelial growth and polysaccharide production in Tricholoma matsutake liquid culture[J].Journal of Bioscienceand Bioengineering,2010(3): 351-355.

[4]Yin XL,You QH.Immunomodulatory activities of different solvent extracts from Tricholoma matsutake(S.Ito et S.Imai) Singer(Higherbasidiomycetes)on normal mice[J].International Journal of Medicinal Mushrooms,2012(14):547-554. [5]You QH,Yin XL.Pulsed counter-current ultrasound-assistedextraction and characterization of polysaccharides from Boletus edulis[J].Carbohydrate Polymers,2014(101):379-385.

[6]You QH,Yin XL.Extraction purification and antioxidant activities of polysaccharides from Tricholoma mongolicum Imai [J].Carbohydrate Polymers,2014(99):1-10.

[7]You QH,Yin XL.Enzyme assisted extraction of polysaccharides from the fruit of Cornus officinalis[J].Carbohydrate Polymers,2013(98):607-610.

[8]刘培贵，袁明生，王向华.松茸群生物资源及其合理利用与保护[J].自然资源学报，1999（3）：245-252.

Extraction of Alcohol-soluble Substances in the Process of the Preparation of Condensed Oral Liquid of Tricholoma matsutake

YAO Hong-wei1,TONG Li-jun2,FU Ting-ting1,XIE Chen-yang1, WU Hong-jun1,ZHAO Feng-chen1,FENG Lei1,ZHANG Xue-yi1
(1.Heilongjiang Forest By-Product and Speciality Research Institute,Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Non-wood Forest Product Development,Mudanjiang 157011,China;2.Heilongjiang Academy of Forestry,Harbin 150081,China）

Extraction of alcohol-soluble substances was a part from preparation of condensed oral liquid of Tricholoma matsutake.The material which use alcohol solution to extract was the residue from water ultrasonic-assisted extraction and weak alkali salt extraction.The content of polyphenols,triterpenoids of Tricholoma matsutake were evaluated.The alcohol solution extraction technology were also discussed.The results showed that ethanol concentration was 80%,extraction time was 30 min and extraction temprature was 70℃,under the optimum conditions the content of polyphenols,triterpenoids were reached at 1.16 mg/100g and 0.23 g/100g.

Tricholoma matsutake;polyphenols;triterpenoids

S646.9

A

1003-8310（2015）02-0070-04

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.02.018

黑龙江省森林工业总局科技攻关项目（sgzjY2012022）。

么宏伟（1981-），男，在读硕士研究生，助理研究员，主要研究方向为林产化学加工学。E-mail:meme917@163.com

**通信作者：付婷婷（1985-），女，硕士，研究实习员，主要从事林产化学加工学方面研究。E-mail:futingting115@126.com

2015-01-15