Talin:细胞黏附动力学过程的关键蛋白

李思锐，孙 阳，罗孝勇，郭向荣

(湖南师范大学生命科学学院分子细胞实验室，中国长沙 410081)

恶性肿瘤是当今严重威胁人类生命的重大疾病之一，转移是恶性肿瘤致死的最主要原因.大多数癌症患者在确诊时，肿瘤细胞已启动转移级联中的一个或多个步骤.恶性肿瘤细胞的转移是指从原发部位浸润性生长、穿透细胞外基质进入脉管(淋巴管或血管)、渗出脉管、在转移部位生长、增殖［1-2］.各种细胞，包括肿瘤细胞，其转移机制是大体相同的，有很大的相似性和保守性，均为一个相互依存的多步骤循环过程［3-4］:A.细胞在趋化因子的刺激下，形成前、后极性(polarity);B.在迁移细胞前部，由肌动蛋白聚合而形成片状伪足、线状伪足的突起(protrusion);C.跨膜受体-整合素与胞内骨架蛋白连接，形成大小不等的黏附斑点(focal adhesion)，从而连接胞外基质与胞内肌动蛋白.当细胞运动时，这些黏附可作为牵引位点;D.细胞尾部的黏附解体和尾部牵缩(rear retraction)，细胞向前移动.阐明细胞转移的分子机制，是正确理解癌症转移、与寻找有效的治疗措施的前提和基础.

1 细胞黏附的动力学过程

细胞黏附，作为细胞转移多步骤循环过程的重要环节，是指细胞与胞外基质的物理相互作用，涉及跨膜糖蛋白受体家族-整合素(integrin)，肌动蛋白细胞骨架和一系列胞质蛋白［5-6］.整合素在结构上为一杂二聚体，由一个α 亚基与一个β 亚基组合而成，分别具有结合配基的胞外区域，单一跨膜区域和胞内区域，但仅β亚基的胞内区域有与信号分子的结合位点.当其胞外区域与胞外配基，如纤粘蛋白(fibronectin)等结合后，导致整合素聚合成簇及胞内区域的构象变化，尽管其胞内区域本身不具有酶活性，但成簇的整合素可激活黏附斑激酶FAK，使其397 位的酪氨酸磷酸化，与Src 激酶的SH2 区域结合，Src 磷酸化衔接蛋白或细胞骨架蛋白，如talin，paxillin，vinculin 等，从而使酪氨酸激酶、细胞骨架蛋白，通过FAK 的SH2，SH3 或富含脯氨酸区域，在整合素的β 胞内区域相互结合形成细胞黏附，并与肌动蛋白细胞骨架相联，使肌动蛋白微丝重组，形成应激纤维(stress fibers).这些新生的黏附(nascent adhesion)，逐渐长大，形成直径1 μm 大小的圆形结构即复合斑(focal complex).复合斑作为质膜扩展的牵引点，传递推动力.当黏附长成稳定结构，变得更大，更成熟时，即形成2 μm 宽，3～10 μm 长的所谓黏附斑(focal adhesion)［7-8］.Focal complex 为小的黏附，位于细胞前沿片状伪足、线状伪足的末端，可稳定片状、线状伪足，传递推动力，促进细胞迁移;focal adhesion 为大的黏附，通常位于细胞尾部应激纤维的末端，与胞外基质紧密附着，抑制细胞迁移［9］.它们的分子组成相同，在成熟度上有差异.

在迁移细胞尾部，可观察到黏附斑的解体(focal adhesion disassembly)，即黏附的释放，使尾部收缩;但在细胞前沿，黏附斑的解体同时伴随着新的黏附斑形成，因而称为黏附斑的转换(focal adhesion turnover).细胞黏附不仅建立了肌动蛋白细胞骨架与胞外基质的紧密联系，同时一系列结构蛋白与调节蛋白组成的蛋白复合物，构成了控制细胞转移的信号通路的网络系统［10］.

2 Talin 在细胞黏附形成中的作用

最新研究表明，有超过180 种蛋白参与黏附的形成，这些蛋白或为结构蛋白，如衔接蛋白或骨架蛋白，直接或间接联接整合素β 亚基的胞内区域与胞内肌动蛋白;或为调节蛋白，如激酶和信号蛋白，调控黏附相关蛋白间相互作用和信号转导［11-12］.图1［9］描述了参与黏附形成的主要蛋白间的相互作用，可以看出，仅talin，filamin 和α-actinin，既与整合素也与肌动蛋白直接联接.研究表明，与filamin 和α-actinin 相比，talin 蛋白，由于其结构以及与其他蛋白的相互作用，在黏附的形成和解体的动力学过程中，具有至关重要的作用.在敲除了talin 基因的胚胎干细胞中，黏附斑和应激纤维均不能形成［13］.

图1 细胞黏附中主要组成蛋白间的相互作用Fig.1 Interactions of main adhesion components in cell adhesion

Talin 基因有两个亚型，talin1、talin2，其编码的蛋白有74%的相似性［14］.目前，对talin2 的了解较少.在结构上，talin1 为一包含2 541 个氨基酸，270 000 的蛋白大分子［15］.其全长蛋白分为球形N 端头部与C 端尾部.头部通称为FERM 区域，可细分为F1，F2，F3 亚区域，其中含有整合素β 胞内区域、肌动蛋白、黏附斑激酶FAK、跨膜蛋白layilin 的结合位点.其尾部含有一个β 亚基、两个肌动蛋白和3 个骨架蛋白vinculin 结合位点.从talin 蛋白结构，可看出，其上可联接整合素β 亚基，下可联接肌动蛋白，并与其他黏附组成蛋白直接或间接联接，因而是整合细胞黏附形成、解体的动力学过程的核心蛋白.

细胞黏附的形成，是指激活成簇的整合素将黏附各组成蛋白，征集进入其β 亚基胞内区域而形成新生细胞黏附的过程.Talin 在细胞黏附形成中，主要在整合素激活与征集其他细胞黏附的组成蛋白中起重要作用.talin 与整合素β 亚基胞内区域的结合可使整合素处于激活状态［16-17］.以RNA 干扰降低talin 表达可显著抑制整合素激活［18］;在talin 低表达细胞中转染talin 基因，可使整合素恢复激活状态［19］.其可能机制为:talin是激活整合素的关键因素——小G 蛋白Rap1A 的下游效应分子，通过talin 与整合素的直接结合，传递Rap1A 信号给整合素［19］.通常，激活的整合素按顺序依次，而非同时征集细胞黏附的各组成蛋白，进入新生的细胞黏附中［20］.然而，何种蛋白处于该征集过程的最上游?一直以来，公认是talin 最早进入细胞黏附中［21-22］.但最近研究表明，黏附斑激酶FAK，先于talin 进入细胞黏附.将FAK 结合talin 位点E1015 突变后，在新生的细胞黏附中，有FAK 存在，但没有发现talin，表明FAK 可先于talin 进入细胞黏附.现已确认，talin处于征集过程中仅次于FAK 的第二位.FAK 需与talin 结合，将talin 征集到新生的黏附中.随后，talin 位于所有其他蛋白的上游，直接或间接与其他黏附组成蛋白相互作用，构成细胞黏附［23］.

3 Talin 在细胞黏附解体中的作用

与细胞黏附的形成相比，对黏附解体的调控机制目前却还不甚明了.已知RhoA-ROCK 信号通路调控肌球蛋白收缩，使黏附斑解体［24-25］.微管在dynamin 和FAK 参与下，可诱导黏附斑解体［26］.但这些机制都还缺乏对具体黏附组成蛋白解体的研究.越来越多的研究表明，钙依赖型蛋白酶Calpain(calcium-dependent protease)可能是诱导黏附斑解体的更重要原因.Calpain 位于黏附斑中，主要有Calpain 1 和Calpain 2 两种亚型.一般认为，细胞前沿的黏附斑的转换，由Calpain1 完成;细胞尾部的黏附斑解体，由Calpain 2 完成［27］.Calpain 2 可将组成黏附斑的所有蛋白，如整合素β1 和β3 的胞内区域，FAK，talin，paxillin，vinculin 等为底物而将其裂解，从而切断整合素与肌动蛋白细胞骨架的联结，使黏附斑解体.

Calpain 2 对talin 蛋白的切割位点为其头部L432 处，将其全长蛋白切割为头部和尾部区域.点突变L432G 可有效抑制Calpain 对talin 蛋白的裂解，从而大大增加活细胞中黏附斑的持续时间［28］，促进细胞黏附.最近，在talin 尾部E2492 处，发现一新的calpain 切割位点，但由于该位点处于talin 蛋白C 末端，可能对黏附斑解体的作用有限［29］.Calpain 对其他黏附组成蛋白，如paxillin，vinculin，zyxin 等的裂解，高度依赖对talin 蛋白的裂解［28］，即Calpain 只有裂解talin 后，才能有效裂解其他黏附组成蛋白.由此可见，Calpain 诱导的黏附斑解体，取决于对talin 蛋白的裂解，因而Calpain 介导的talin 蛋白的裂解在黏附解体中起关键作用.

Calpain 裂解蛋白的作用机制，已基本明确［30-31］.通常，Calpain 在毫摩级钙离子浓度下，可处于激活状态.但在活细胞中，很难达到此种浓度.其激活机制为，在胞外表皮生长因子(EGF)刺激下，激活MAPK 通路，最终激活ERK.ERK 磷酸化Calpain 50 位的丝氨酸，从而激活Calpain.蛋白激酶A(PKA)，可磷酸化Calpain 269 位丝氨酸或379 位苏氨酸，从而抑制Calpain 的激活，可抵消ERK 对Calpain 的激活效果［32］(图2［27］).

图2 Calpain 裂解蛋白的作用机制Fig.2 Mechanism of calpain-mediated proteolysis

4 Talin 与个体发育和肿瘤浸润转移的关系

由于talin 在黏附的形成、解体中的重要作用，对talin 蛋白的研究已成为细胞黏附的热点，其与个体发育和疾病的发生、发展的关系，也得到普遍关注.敲除talin1 的小鼠胚胎受精后8.5～9.5 d 由于原肠胚发育停滞，导致胚胎致死［33］.在许多癌症转移病人中均存在Calpain 2 表达上调［34-35］，而Calpain 2 影响细胞转移的作用主要是通过切割talin 而实现的，因而人们开始在talin 蛋白结构中寻找影响Calpain 2 活性的位点.对细胞黏附talin 头部的苏氨酸、丝氨酸质谱分析表明，talin 头部存在几个高化学计算磷酸化位点，这些位点可能控制Calpain 介导的对talin 蛋白的裂解，以及影响talin 与其他蛋白间的相互作用［15］，但目前还极少有talin 与肿瘤浸润转移直接相关的研究报道.有理由相信，随着对talin 蛋白结构、功能，以及与其他蛋白间相互作用的研究，talin 可成为治疗包括癌症等与细胞转移有关疾病的有用的分子靶标.

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