酸性亚硫酸盐预处理对棉杆糖化效率的影响

朱文远， 姜 波， 寇佳文， 金永灿

（南京林业大学 江苏省制浆造纸科学与技术重点实验室，江苏 南京 210037）

酸性亚硫酸盐预处理对棉杆糖化效率的影响

朱文远， 姜 波， 寇佳文， 金永灿

（南京林业大学 江苏省制浆造纸科学与技术重点实验室，江苏 南京 210037）

采用酸性亚硫酸盐法预处理棉杆进行生物质转化，研究了硫酸用量、亚硫酸氢钠用量、预处理温度和保温时间等对棉杆底物酶水解效率和棉杆组分溶出的影响，并研究了棉杆酶水解过程中添加木素磺酸盐对棉杆底物酶水解效率的影响。结果表明，硫酸用量的增加可以明显提高半纤维素的降解溶出，亚硫酸氢钠用量的提高可以增加木素的磺化溶出，一定的预处理温度和保温时间是必要的，但过高的预处理温度和过长的保温时间对棉杆酶解效率没有益处。综合考虑，酸性亚硫酸盐预处理棉杆的最佳条件为：硫酸用量2.2%，亚硫酸氢钠用量8.0%，预处理温度170℃，保温时间40 min。纤维素酶用量为15 FPU/g（绝干底物）时，棉杆底物酶水解糖化率为83.9%。只添加商品木素磺酸盐，添加量为3.0%（对绝干底物），棉杆底物纤维酶水解转化率达到93.4%，基本达到工业生产的标准；黑液可以取代部分商品木素磺酸盐，但全部取代，效果略差。

亚硫酸盐；棉杆；酶解；木素磺酸盐；预处理

随着全球经济的快速发展，人们对能源的需求量越来越多。石化燃料作为不可再生能源，终究会枯竭。因此，各国研究者都对可再生的的生物质能源进行了大量的研究。木质纤维原料主要成分是纤维素、半纤维素和木素，木素将纤维素和半纤维素包裹起来，半纤维素填充其间。纤维素和半纤维素通过化学降解或者酶解为单糖，进一步发酵转化成生物酒精等。因此，进行木质纤维素进行生物质转化之前，需要通过预处理尽量将纤维素暴露出来，以便酶和微生物能够接触到纤维素进行生物质转化。中国是农业大国，木材资源匮乏，而农业废弃物丰富，每年秸秆产量约6.5亿吨[1]。棉花作为我国极为重要的农业经济作物，分布非常广阔。经过长期的不断演化和发展，我国棉田正逐步向黄河流域、长江流域和新疆三大产棉区集中[2]。棉杆作为棉花的主要剩余物，每年产量超过2 500万吨[3]。棉杆长期用作燃料或者堆放腐烂掉，既造成了环境污染也是资源浪费。棉杆皮含杂质较多，制成纸浆存在白度低、尘埃度高等缺点，难以成为高档纸浆。棉杆用作生物质资源转化，既是对环境保护的贡献，也不与传统造纸等形成资源竞争。

目前，针对棉杆预处理的研究不多。Silverstein等[4]研究烧碱法、稀酸与臭氧预处理棉杆，其中臭氧法预处理后的纤维水解转化效率达到49.8%；另外，Jian Shi[5]采用微生物预处理法，Ayse Eren Pütün[6]采用快速裂解法，邓辉等[7]对比了烧碱法与稀酸法，这些方法预处理后的底物酶水解转化效率均不高。齐临冬等[8]采用酸性亚硫酸盐预处理棉杆，研究了pH值、预处理温度、化学药品用量等对棉杆酶水解效率的影响，结果表明当体系pH值在2.65、预处理温度180℃、保温20 min时底物酶水解转化效率最高为70.1%。这明显比前面几种方法的纤维素酶水解转化效率高，但仍有约30%的底物纤维素不能酶解转化。酸性亚硫酸氢盐溶液中含有H+、HSO3-和SO32-等，磺酸根离子可以进攻木素使其磺化溶出，酸性环境下半纤维素可以降解成单糖溶于废液中，从而使纤维素尽可能多的暴露出来。因此，酸性亚硫酸盐作为木质纤维生物质转化的预处理方法，不仅能够具有较高的酶解转化效率，而且具有降低磨浆能耗等优点。本研究采用酸性亚硫酸盐法预处理棉杆，继续优化条件，并充分利用预处理废液中溶出的磺化木素在底物酶水解过程中作为催化剂提高底物纤维素酶水解转化效率。

1 实验

1.1实验材料

棉杆取自山东临沂，风干后的棉杆切断成长20～40 mm，厚度2～6 mm，收集密封于封口袋内平衡水分。分析得出，水分8.3%，葡聚糖（纤维素）35.87%，聚戊糖（半纤维素）15.49%，木素26.30%。

实验用纤维素酶是novozymes Cellic CTec2，为复合纤维素酶，滤纸酶活为250 FPU/mL，由诺维信公司提供。

其他，如硫酸、亚硫酸氢钠、无水乙酸钠、冰醋酸等均为分析纯，购自南京大光明化学品有限公司；木素磺酸盐为工业级。

1.2仪器和方法

1.2.1 水分测定

参见文献[9]。

1.2.2 化学组分分析（酸水解法）

称取0.3 g（绝干）试样，放于25 mL小烧杯中，加入3 mL的72%浓硫酸，置于常温下使其充分润胀，其间不停地用玻璃棒搅拌；2.5 h后补加84 mL的蒸馏水，调节酸浓度至4%，搅拌均匀后将处理后的试样全部转移到封口蓝盖瓶中，将蓝盖瓶置于灭菌锅中，在121℃的条件下水解1 h；水解完成后，用G3砂芯漏斗抽吸过滤，将G3砂芯漏斗和其上面留着的固体一同放入烘箱在105℃烘4 h，计算木素含量；分离得到的液体，通过用带有0.22 μm孔径聚四氟乙烯微孔滤膜的注射过滤器进行真空抽滤，用移液枪移取1 mL于2 mL的塑料封口试管，同时加入40 μL 50% NaOH溶液摇匀，调节pH值；冷藏试样，准备送HPLC测成分得出葡聚糖和聚戊糖的含量。

1.2.3 预处理过程

实验设备为旋转式油浴加热蒸煮器，选用1.25 L的不锈钢蒸煮罐8个，每罐取棉杆片100 g（绝干量），根据实验条件加入配好的化学药品液体，并补加够量的水，拧紧后置于油浴蒸煮器加热和保温；蒸煮后的混合物，用200目浆袋过滤分离蒸煮废液，固体棉杆调节到10%浓度，均匀连续的加入盘磨磨浆机，盘磨间隙为0.4 mm；磨浆后的浆料用200目浆袋洗涤两次，手动拧干撕碎置于塑料密封袋中，准备测量水分和实验用；另外，将盘磨齿盘上的残留棉杆也取出，测量水分后，与磨后浆加一起计算化学预处理得率。

1.2.4 底物酶水解过程

棉杆底物酶水解的条件是：浆料浓度为2g/100 mL，50 mL乙酸/乙酸钠缓冲溶液，纤维素酶15.0 FPU/g（对绝干底物）；体系pH为4.8，水解在恒温培养振荡器内进行，水解温度保持在50℃，转速定为180 r/min。酶解72 h时取样，每次取2 mL，用G3过滤漏斗抽吸过滤，将分离得到的液样溶液，用移液枪移取5 mL至注射器内，然后通过带有0.22 μm孔径的聚四氟乙烯微孔膜的注射过滤，抽取0.2 mL的上层清液加0.8 mL的去离子水混合，将溶液稀释5倍，转移进入进样瓶。放入冰箱，准备送HPLC测量糖含量。

2 结果与讨论

棉杆结构接近木材，但是一年生植物，因此其结构和化学组分介于木材和禾本科之间。酸性亚硫酸盐中酸可以提供酸性环境，降解溶出半纤维素；而磺酸根离子攻击木素使其成为磺化木素而溶出。因此，经过酸性亚硫酸盐预处理后的棉杆底物纤维素尽可能的暴露易于接触到纤维素酶，从而提高底物酶水解转化效率。实验也研究了不同化学药品用量、预处理温度和保温时间对底物纤维素酶水解效率的影响；另外，磺化木素具有亲水性基团（磺酸根）和疏水性基团（苯环结构），具有表面活性剂的性质，实验也研究了酶解过程中添加商品木素磺酸盐和预处理废液（含有预处理过程中溶出的木素磺酸盐）。

2.1硫酸用量对棉杆酶水解糖化效率的影响

酸性亚硫酸盐预处理木质纤维原料过程中，硫酸浓度可以调节体系pH值，在一定的温度和保温时间下，木质纤维原料半纤维素降解为单糖溶于预处理废液；当然，这个过程中不可避免的也有纤维素的降解溶出和木素的缩合反应，以及溶出的单糖进一步产生糠醛和羟甲基糠醛，糠醛和羟甲基糠醛对后续发酵产生抑制作用。因此，选择合适的硫酸用量对优化酸性亚硫酸盐预处理棉杆很重要。实验固定了固液比为1∶4，预处理温度150℃，升温时间30 min，保温40 min，亚硫酸氢钠用量6.0%（对绝干原料，下同）。硫酸用量从0到4.4%（对绝干原料，下同），结果如图1和图2所示。

图1 硫酸用量对棉杆酶解转化效率影响

图2 硫酸用量对棉杆组分溶出的影响

从图1可以看出，无论是低亚硫酸氢钠用量还是高的亚硫酸氢钠用量，硫酸用量对棉杆酶解转化效率影响明显。随着硫酸用量的增加，棉杆底物纤维的酶水解转化效率提高明显，但较高亚硫酸氢钠用量时（6.0%）增速没有低亚硫酸氢钠用量（3.0%）快。这可能是二者的相互作用的原因，亚硫酸氢钠的加入，一方面可以增加棉杆木素的溶出，但另一方面亚硫酸氢钠的分解，也消耗了部分硫酸，导致体系pH值略有上升，从而影响了半纤维素（聚木糖）的降解。增加硫酸用量，降低了预处理体系的pH值，从而影响了棉杆组分（半纤维素、木素）的溶出，结果如图2所示。图2表明，酸性亚硫酸盐预处理棉杆过程中，随着硫酸用量的增加，半纤维素（聚木糖）溶出明显，但超过2.2%以后，上升幅度变缓。这说明当半纤维素降解到一定程度以后，进一步提高半纤维素的溶出就比较困难了。这个结果与文献关于酸性亚硫酸盐预处理木材原料相差较大[10-12]，这可能也是目前棉杆原料酶解效率无法进一步提高的原因。硫酸用量对木素的溶出先增加后减少，硫酸用量在1.1%的时候木素溶出最高为41.4%（对原料，下同）。在酸性亚硫酸盐处理棉杆过程中，和等攻击木素使其磺化降解溶出，但酸性条件却导致木素缩合，pH越低，缩合越严重，结果造成木素随着硫酸用量的增加反有下降趋势。综合考虑，硫酸用量在1.1%～2.2%较佳。

2.2亚硫酸氢钠用量对棉杆酶水解糖化效率的影响

预处理的目的是脱出部分半纤维素和木素，尽量提高酶和微生物与纤维素接触的机率。亚硫酸氢钠可以为体系提供HSO3-和SO32-等离子，这些离子可以进攻木素基团使其磺化降解。因此，亚硫酸盐与硫酸协同作用降解溶出木素和半纤维素，提高纤维素暴露的面积。实验过程中，选择固定了硫酸用量为2.2%，液比4，预处理温度170℃，升温40 min，保温40 min，亚硫酸氢钠用量0%～8.0%。亚硫酸氢钠用量对棉杆底物纤维酶水解效率的影响如图3所示，对棉杆组分溶出影响如图4所示。

从图3可以看出，随着亚硫酸氢钠用量的增加，棉杆底物纤维酶水解效率一直提高，超过6.0%以后增加趋势减缓。当硫酸用量2.2%时，亚硫酸氢钠用量8.0%时，棉杆底物最高酶解转换率最高83.9%。虽然本实验没有进一步提高亚硫酸氢钠用量，但参考齐临冬等[8]研究结果可知，亚硫酸氢钠用量提高到8.0%以后，对酶解效率增加效果不明显。亚硫酸氢钠对棉杆组分溶出如图4所示。图4结果表明，亚硫酸氢钠对聚戊糖的溶解先增加后降低，这可能是因为适当增加亚硫酸氢钠，提高了木素的溶出，暴露出半纤维素，从而提高了半纤维素的降解，但随着亚硫酸氢钠用量的增加，消耗了更多的硫酸，导致体系pH提高，从而减弱了半纤维素的降解；木素的溶出随着亚硫酸氢钠用量的增加而增加，超过6.0%以后木素溶出减缓。参考齐临冬等研究结果，亚硫酸氢钠用量增加到8.0%以后不必再提高用量。

图3 亚硫酸氢钠用量对棉杆酶解转化效率影响

图4 亚硫酸氢钠用量对棉杆组分溶出的影响

2.3预处理时间和温度对棉杆酶水解糖化效率的影响

预处理过程中，化学药品要在一定的温度下经过一定反应时间对木质纤维原料组分才起作用。实验研究了不同温度随着预处理时间的延长，对棉杆底物纤维素酶水解效率和棉杆组分溶出的影响，固定的预处理条件为：液比4∶1，硫酸用量2.2%，亚硫酸氢钠用量8.0%，结果如图5所示。

从图5可以看出，预处理温度和保温时间对棉杆纤维酶水解转化效率均有明显影响。预处理温度越高，棉杆底物纤维酶水解率越高；预处理温度一定时，保温时间延长可以提高底物纤维酶水解转化率。预处理温度超过170℃后，温度的增加对提高棉杆底物纤维素酶解率影响不大；而预处理温度越高，预处理过程中降解的单糖在酸性条件下会被衍生化为糠醛和羟甲基糠醛等抑制剂，这些对后续的发酵形成抑制作用。因此，在保证棉杆底物酶水解效率的同时，尽量降低预处理温度。实验选择的最佳预处理温度为170℃。保温时间的延长，可以提供化学药品与半纤维素和木素的充分反应。由图5发现，预处理温度170℃和180℃在保温40 min时，其底物纤维素酶解转化率基本相同，再延长时间，170℃反而效果更好。这可能是因为较高的预处理温度随着保温时间的延长，缩合的木素重新沉淀在底物表面阻碍了酶与纤维的接触造成的。

图5 预处理温度/时间对棉杆酶水解效率的影响

图6 预处理温度/时间对棉杆组分溶出的影响

进一步研究预处理温度和保温时间对棉杆组分溶出，结果如图6所示。虚线表示的是不同温度木素随保温时间延长的溶出趋势，实线表示的是聚戊糖（半纤维素）随保温时间延长的降解趋势。从图6可以看出，木素和半纤维素的降解溶出均随着预处理温度和保温时间增加而提高；较高的预处理温度（超过170℃），保温超过40 min后，提高均不明显。这也与前面的酶解效率变化规律一致，说明确实是组分溶出受到限制导致很难进一步提高棉杆的酶水解转化效率。

2.4添加木素磺酸盐对棉杆酶水解糖化效率的影响

木素磺酸盐具有亲水性基团和疏水性基团，具有表面活性剂性质，亲水性基团易于吸附酶，而疏水端易于沉淀到棉杆底物上。前期探索实验发现在酶水解过程中添加一定量的木素磺酸盐可以提高棉杆纤维素酶水解转化效率。实验选择使用商品木素磺酸盐和预处理溶出废液。预处理过程中，一次绝干原料100 g，预处理条件：硫酸用量2.2%，亚硫酸氢钠用量6.0%，温度170℃，保温时间40 min，液比4∶1，理论黑液400 mL。磨浆后的得率58%，绝干固体底物58 g，溶出木素按照35%的溶出率计算，黑液木素浓度为100×35%×29.8%/1 000 g/mL＝0.026 g/mL。酶解过程中，用理论木素黑液浓度的量取代最佳条件木素磺酸盐量，黑液以补加水的形式加入。结果如表1所示。

表1 木素磺酸盐对棉杆酶水解糖化效率影响

（续表1）

从表1可以看，在棉杆底物酶解过程中添加木素磺酸盐可以明显改善棉杆底物纤维素酶解转化效率。1#～5#添加的是商品木素磺酸盐，随着木素磺酸盐用量的增加，棉杆底物纤维素酶解效率先增加后减小，用量3.0%（对绝干棉杆底物）为最佳用量，此时的棉杆底物纤维素酶解效率为93.4%，基本达到可以工业化的指标。分析原因，可能是适量的木素磺酸盐由于其表面活性剂的性质增加了酶与底物纤维接触的效率，或者木素磺酸盐具有一定的催化作用；过量的木素磺酸盐可能吸附在棉杆底物表面，堵塞了其表面开孔通道，反而阻碍了酶与纤维素接触。6#是按照计算的相当于3#木素磺酸盐用量（最佳用量）的黑液体积，7#是用黑液取代了部分商品木素磺酸盐。由表1可以看出，添加蒸煮黑液也可以提高棉杆底物纤维素酶水解效率，但效果没有商品木素磺酸盐效果好；部分取代效果好于全部取代，但低于全部商品木素磺酸盐。这可能是因为黑液含有抑制酶作用的抑制剂，或者是预处理过程中产生的木素磺酸盐的磺化度没有商品木素磺酸盐的磺化度高。总的来说，添加木素磺酸盐以及用黑液部分取代商品木素磺酸盐可以提高棉杆底物纤维素酶水解效率。

3 结论

酸性亚硫酸盐预处理棉杆可以有效提高棉杆纤维酶水解糖化效率，硫酸用量、亚硫酸氢钠用量、预处理温度和保温时间，以及酶解过程中添加木素磺酸盐，均可影响棉杆酶水解效率。具体结论如下：

1）硫酸用量的增加可以降低体系pH值，增加半纤维素的降解溶出，可以适当提高木素溶出，从而提高棉杆底物酶水解效率；亚硫酸氢钠用量增加可以明显提高棉杆木素的溶出，对半纤维素的降解不明显，可以明显改善棉杆底物纤维素酶解效率；一定的温度和保温时间是保证预处理反应的必要条件，但温度和时间也不宜过高和过长，否则不但不能提高酶解转化效率，反而产生较多的抑制剂。综合考虑，酸性亚硫酸盐预处理棉杆的最佳条件为：硫酸用量2.2%，亚硫酸氢钠用量8.0%，预处理温度170℃，保温时间40 min。纤维素酶用量为15 FPU/g（绝干底物）时，棉杆底物酶水解糖化率为83.9%。

2）添加木素磺酸盐可以提高棉杆底物纤维素酶水解效率，用黑液取代部分商品木素磺酸盐也可以。只添加商品木素磺酸盐，添加量为3.0%（对绝干底物），棉杆底物纤维酶水解转化率达到93.4%，基本达到工业生产的标准；黑液可以取代部分商品木素磺酸盐，但全部取代的话，效果略差。

总的来说，酸性亚硫酸盐预处理棉杆效果优于其他方法，而且预处理过程中产生的木素磺酸盐可以在后续的酶解糖化过程中加以利用。亚硫酸盐制浆技术成熟，可以利用现有技术和设备进行改进，容易实现工业化。

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Effects of Bisulfite Pretreatment
on Enzymatic Saccharification of Cotton Stalk

ZHU Wen-yuan, JIANG Bo, KOU Jia-wen, JIN Yong-can

（Jiangsu Key Laboratory of Pulp and Paper Science and Technology, Nanjing Fotestry University, Nanjing 210037, China）

Bisulfite pretreatment (SPORL) on bioconversion of cotton stalk was investigated. The dosages of H2SO4and NaHSO3, pretreatment temperature, and duration time were the main factors of bisulfite pretreatment on enzymatic saccharification of cotton stalk and compositions’ dissolution from cotton stalk. The effects of adding lignosulfonate during enzymatic hydrolysis of cotton stalk were also studied in this study. Hemicelluloses’degradation was significantly improved by increasing the dosage of sulfuric acid, and lignin dissolution was improved by increasing the amount of sodium bisulfite. The suitable pretreatment temperature and duration time was necessary. Considering all factors, the optical pretreatment conditions were as follows: sulfuric acid dosage of 2.2%, sodium bisulfite charge of 8.0%, pretreatment temperature of 170℃, and duration time of 40 min. The highest cellulose conversion of 83.9% from cotton stalk substrate pretreated by the above optical conditions by adding enzyme dosage of 15 FPU/g (on o.d. substrate). It was also found that the cellulose enzymatic hydrolysis yield of 93.4% was obtained by adding market lignosulfonate of 3.0%, and the waste liquor from pretreatment could take part of market ligosulfonate.

bisulfite; cotton stalk; enzymatic hydrolysis; lignosulfonate; pretreatment

TQ353.42

A

1004-8405(2015)04-0023-07

10.16561/j.cnki.xws.2015.04.07

2015-08-20

国家自然科学（青年）基金（31200454）；南京林业大学2013年大学生实践创新训练计划项目。

朱文远（1978～），男，博士，讲师；研究方向：农业废弃物生物质精炼及造纸湿部脱水机理及器材等研究。ppzhuwy12@126.com