流式细胞术操作软件在小鼠造血干细胞检测中的应用比较

梁昊岳，杨晚竹，程雪莲，王金宏

流式细胞术操作软件在小鼠造血干细胞检测中的应用比较

梁昊岳，杨晚竹，程雪莲，王金宏

目的：探讨流式细胞术中不同分析软件在小鼠造血干细胞分析中的特点和差异。方法：使用小鼠骨髓细胞悬液作为实验材料，在BD AriaIII和BD Influx流式细胞仪上检测小鼠造血干细胞，分别应用FACSDiva、FACSSortware软件对检测数据进行分析，并比较分析结果。结果：FACSDiva和FACSSortware软件在参数调节、补偿调节、圈门、数据保存和分选设置方面存在细微差异，均可以实现多色流式分析和高速流式分选。结论：FACSDiva和FACSSortware软件分析同一样本所得结果有较高的一致性，均是使用流式细胞仪不可或缺的工具。

流式细胞术；造血干细胞；FACSDiva软件；FACSSortware软件

0 引言

造血系统的细胞发生于骨髓中的一群具有自我更新能力的细胞，即造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）[1]。造血干细胞移植是恶性血液疾病的一种重要治疗手段，在科学研究中常利用动物模型模拟人体的生理条件来考察造血干细胞移植效果，流式细胞术在临床和科研监测移植效果中都发挥着重要的作用。目前关于检测小鼠骨髓造血干细胞表型的方法有LSK、SLAM、SP等。Osawa等利用CD34-/lowckit+Sca-1+Lin-组合检测小鼠HSC是比较常用的方法。SLAM家族的某些分子，其配体CD150和CD48也是分离小鼠HSC的标志。CD48-CD150+是高度富集的造血干细胞/祖细胞的标志[2-6]。Goodell等定义具有外排染料Hoechst33342的细胞为侧群细胞（SP细胞），用来筛选小鼠HSC[7-9]。

应用流式细胞术检测小鼠骨髓造血干细胞，其结果不仅受样品固有性质、样品的处理方法和荧光染色的影响，还受流式操作软件的影响。在实际工作中，美国BD公司的BD Aria和BD Influx分别是应用最多和最高端的流式细胞仪，其相应的进行流式分析和分选操作的专业软件分别为FACSDiva和FACSSortware，但是目前对上述2款软件使用操作方法的比较尚无报道。该研究旨在对不同流式操作软件的使用方法进行比较，并对应用不同软件检测小鼠骨髓造血干细胞的分析结果进行比较，希望能对流式操作软件的使用有一定借鉴意义。

1 材料与方法

1.1 材料

BD AriaIII流式细胞仪，BD Influx流式细胞仪，Accudrop Beads（美国Becton Dickinson公司），Rainbow Beads（美国Becton Dickinson公司），APC-Cy7标记的抗小鼠Lineage抗体，APC标记的抗小鼠ckit抗体，FITC标记的抗小鼠CD34抗体，PE-Cy7标记的抗小鼠Sca-1抗体，PerCP标记的抗小鼠CD150抗体，PE标记的抗小鼠CD41抗体，1×PBS鞘液，磷酸缓冲液。

1.2 方法

1.2.1 样品制备

将Rainbow Beads和Accudrop Beads用无菌鞘液稀释备用，取小鼠骨髓细胞，使用流式抗体染色，避光30min后，用2mL磷酸缓冲液洗涤细胞，离心后重悬于PBS溶液，溶液中细胞浓度控制在107个/mL以下，2 h内上机进行流式分析。

1.2.2 样品检测

开启BD AriaIII流式细胞仪，用Rainbow Beads检测仪器各通道，应用FACSDiva检测软件。在前向角散射光/侧向角散射光（FSC/SSC）散点图中显示细胞群，利用DAPI染料除去死细胞，调节荧光电压等参数，记录总细胞数不少于200 000个。开启BD Influx流式细胞仪，用Rainbow Beads调节光路，检测仪器各通道，应用FACSSortware检测软件。相同方法调节参数，记录总细胞数不少于200 000个。

1.2.3 小鼠骨髓造血干细胞流式分析

分别应用FACSDiva和FACSSortware检测软件，对小鼠骨髓造血干细胞进行流式分析，圈选表型为Lin-CD34-c-kit+sca-1+CD150+CD41-的小鼠骨髓造血干细胞，分析细胞群比例。

2 结果

2.1 FACSDiva和FACSSortware软件总观

FACSDiva软件总观主要由数据获取、参数调节、流式图显示、补偿调节、液流显示、流式分选、数据保存等几个模块组成。FACSSortware软件总观主要由数据获取、参数调节、流式图显示、补偿调节、流式分选、数据保存等几个模块组成。2款软件都可以完成多激光、多色的流式分析和高速流式分选，二者在总观方面有如下区别：

（1）FACSDiva软件可全屏显示于2台计算机显示器，操作较为方便，显示空间较大，各模块显示可不重叠；FACSSortware软件只能显示于单台计算机显示器，显示空间较小，各模块显示可能会有重叠，但节省成本和空间。

（2）FACSDiva软件中有流式细胞仪液流情况界面，显示为“70 micron”2个模块；FACSSort-ware软件中没有这2个模块，而是将它们分别单独显示于计算机显示器上方的Drop显示屏和Stream显示屏。

2.2 FACSDiva和FACSSortware数据获取模块

FACSDiva和FACSSortware软件数据获取模块包括数据获取、记录、刷新、记录时间和细胞个数的“Acquire”、“Record”、“Restart/Reset”、“ElapsedTime”、“Rate”选项，二者主要区别如下：

（1）FACSDiva软件数据获取模块包含设置收集数据的“Stopping Gate”和“Storage Gate”；而 FACSSortware将这2个选项设置在数据保存模块中。

（2）FACSDiva软件数据获取模块包含上样和调节流速的“Load”和“Flow Rate”选项；FACSSortware中没有上述2个选项，上样和调节流速的按键和旋钮被设置在机器上，这种设置适合于FACSSortware的单屏幕显示方式，将软件的部分功能安排在机器中，节约软件显示所需的空间。

2.3 FACSDiva和FACSSortware参数调节模块

FACSDiva和FACSSortware软件参数调节模块都包括各激光流式通道显示、电压调节、线性/对数方式选择等选项，二者差别如下：

（1）FACSDiva可以在软件中删除不需要的参数；FACSSortware不能删除。

（2）FACSSortware可以在参数调节模块中为各个通道添加标注，以表示这一荧光素连接的抗体；而FACSDiva需要在另外的“Experiment Layout”界面下实现这一功能。

2.4 FACSDiva和FACSSortware补偿调节模块

FACSDiva和FACSSortware软件补偿调节模块都包括补偿调节的基本功能，二者差别如下：

（1）作为分析软件，FACSDiva只需勾选“Enable Compensation”即可时刻观察调节补偿后的流式图形变化，而FACSSortware有时则需要在每次调节补偿后手动点击“Visualize”才能观察到流式图形的变化，这是FACSSortware软件的一个小的不便之处。

（2）不同样本的补偿显示方面，FACSDiva只需在数据获取模块选择“Next Tube”，补偿数据会自动显示，而FACSSortware则需依次改变每个流式图显示的样本数据，并在补偿调节模块中的“Data Source”选择相应的样本，才能显示不同样本的补偿。

2.5 FACSDiva和FACSSortware圈门显示方式

2款软件都可逐级圈门，并在等级图中显示。二者的区别在于：使用FACSDiva软件圈选子门时需在流式图中点击右键“Show Populations”选择显示上一级门，再在上一级门的基础上圈选子门；使用FACSSortware软件圈选子门时需要首先点击图标，使流式图显示上一级门，再用鼠标左键单击上一级门图标，才可以实现圈选子门。若未用鼠标左键单击上一级门图标，则圈选出的子门在等级图中显示为上一级门的平行门。从圈门的角度分析，FACSDiva软件更为便捷。

2.6 FACSDiva和FACSSortware数据保存模块

2款软件都可以实现流式数据的按要求保存。二者的区别在于：FACSDiva软件需要在获取数据后手动将数据存储到目的文件夹中；FACSSortware软件可将数据的获取和存储同时进行，节省了操作时间。FACSSortware软件中“FCS File”选项下显示的即为存储路径和文件名，用户可以自行选择。

2.7 FACSDiva和FACSSortware流式管分选模块

FACSDiva和FACSSortware软件流式管分选模块都可实现高速二路分选和四路分选，并可在软件中选择分选模式，单细胞分选都可选择“Single Cell”模式。同时，软件可以设置连续分选和固定细胞个数分选，并能进行Accudrop调节等[10]。二者的区别在于：

（1）FACSSortware软件能够自动避免各路分选细胞的重叠所造成的逻辑错误；FACSDiva软件需要操作者自行判断分选设置的门是否存在逻辑错误。

（2）FACSSortware软件通过设置每路分选都有控制开始和停止的选项，可以实现在多路同时分选过程中停止单一路的分选；FACSDiva软件只能统一开始和停止分选。

2.8 FACSDiva和FACSSortware 96孔板分选模块

2款软件都可以实现96孔板分选等微孔板分选和单细胞分选。二者的区别在于：

（1）FACSDiva软件在单击“Sort”开始分选时，微孔板会自动移动到设置好的分选位置；FACSSort软件需要先单击“Sort Ready”，将微孔板移动到设定的位置。

（2）FACSSort需要用鼠标将微孔板中需要分选的区域选中，使阴影覆盖这一区域，才可以顺利分选，否则阴影未覆盖的区域不能进行分选；FACSDiva软件无需这项操作，一经开始即可连续分选。

2.9 FACSDiva和FACSSortware微孔板位置设置模块

2款软件都可以进行微孔板位置调节，通过上下左右箭头设置微孔板位置，并单击“Set Home”确定位置。二者的区别在于：FACSSortware软件可以通过数字设定微孔板横纵坐标的位置，这种设置更为精细；FACSDiva软件只能通过大格或小格的移动调节微孔板位置，无数字化设置。

2.10 应用FACSDiva和FACS Sortware软件分析小鼠骨髓造血干细胞流式结果

图1（a）和图1（b）分别为FACSDiva和FACSSortware软件分析小鼠骨髓造血干细胞流式结果。P6门内为小鼠骨髓造血干细胞，其表型为Lin-CD34-c-kit+sca-1+-CD150+CD41-。FACSDiva和FACSSortware软件分析小鼠骨髓造血干细胞群比例分别为 17.3%和17.9%，分析结果具有较高的一致性。

图1 应用FACSDiva和FACSSortware分析小鼠骨髓造血干细胞流式结果

3 讨论

近年来，流式细胞仪在血液学，特别是血液病诊断方面有着较为广泛的应用[11-12]，流式软件的功能也更加强大，在分析细胞周期、细胞凋亡等方面发挥着重要的作用[13-14]。2003年，BD推出了第一台FACSAria分析分选型流式细胞仪。后经多次更新换代，目前主要使用的为BD FACSAriaⅢ。BD FACSDiva软件是BD LSR系列、BD Canto系列、BD Aria系列流式细胞仪通用的流式操作软件，能有效地支配仪器、获取及分析数据、完成质控等。它可以将一个实验方案由一个平台移动到另一个平台，给仪器的使用者和维护者提供了一个高效、便捷的工具，保证了数据的可靠性。BD Influx是当今最高端的、可与Beckman Moflo XDP相媲美的流式细胞分析分选仪。BD FACSSortware软件提供对流式细胞仪的全面控制，从仪器设置到实验获取的补偿调节、分析和分选，为操作者提供全方位的帮助。由于FACSSortware软件为单个显示器显示，所以部分功能被设置在机器上，如上样、调节流速、显示液流状态等。从使用角度分析，FACSDiva在参数设置、补偿调节和圈门方面更加方便，FACSSortware软件在数据存储、自动纠正分选中的逻辑错误、开始和停止单一路分选、数字化调节微孔板位置等方面有更多的优势。

实验中发现，FACSDiva软件和FACSSortware软件在使用过程中会出现与机器失去连接或死机的现象，影响软件的正常使用。此外，使用FACSSortware软件存在分选时有时不能显示分选所得细胞数、使用96孔板分选时微孔板不能正确移动等问题，这些都有待进一步改进。同时，FACSDiva软件和FACSSortware软件都应增加上样保护功能，即当样本接近吸空时自动停止上样，避免管路内进入气泡或液流断开，影响后续使用。只有不断改进软件的设置和功能，提高软件对使用者的友好度，软件才能为更多使用者所接受和掌握，更好地发挥其应有的作用。

综上所述，该文分析和比较了两款常用的流式细胞仪操作软件和小鼠骨髓造血干细胞流式结果，为流式操作软件的使用提供了借鉴。流式操作软件是使用流式细胞仪不可或缺的工具，可以预见，在不久的将来，在FACSDiva和FACSSortware软件的帮助下，BD Aria系列和BD Influx分析分选型流式细胞仪在临床和科研领域的应用范围会更加广阔、更为深入，不断为人类认识疾病、治疗疾病提供帮助和动力。

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（收稿：2014-10-06 修回：2014-12-30）

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Comparison of kinds of flow cytometry operation software in mice bone marrow hematopoietic stem cell analysis

LIANG Hao-yue,YANG Wan-zhu,CHENG Xue-lian,WANG Jin-hong
（State Key Laboratory of Experimental Hematology,Institute of Hematology&Blood Disease Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Tianjin 300020,China）

ObjectiveTo explore the characteristics and differences of kinds of flow cytometry operation software for mice bone marrow hematopoietic stem cell analysis.MethodsWith mice bone marrow cells as experimental materials,cells were stained by antibodies and measured by BD AriaIII and BD Influx flow cytometer.The results of hematopoietic stem cell were analyzed and compared by FACSDiva and FACSSortware software.ResultsDiscrepancies of FACSDiva and FACSSortware involved parameter regulation,compensation regulation,gating,data storage and sorting parameter setting. Both of the softwares were effective to complete multicolor flow analysis and high-speed cell sorting.ConclusionResults of the same sample analyzed by FACSDiva and FACSSortware can obtain high consistency.[Chinese Medical Equipment Journal，2015，36（3）：5-8]

flow cytometry;hematopoietic stem cell;FACSDiva software;FACSSortware software

R318；TP316

A

1003-8868（2015）03-0005-04

10.7687/J.ISSN1003-8868.2015.03.005

国家自然科学基金资助项目（81001377）

梁昊岳（1987—），男，技师，主要从事流式细胞测试方面的工作，E-mail：yueyue_0612@aliyun.com。

300020天津，中国医学科学院北京协和医学院血液病医院（血液学研究所），实验血液学国家重点实验室（梁昊岳，杨晚竹，程雪莲，王金宏）

王金宏，E-mail：jyuwang@sina.com