淫羊藿苷对Tg2576小鼠学习记忆功能及海马神经细胞再生的影响*

蔡 锐，李 菲，董红心，2，石京山

(1.遵义医学院药理学教研室基础药理省部共建教育部重点实验室，贵州遵义 563099;2.美国西北大学精神病学与行为科学实验室，伊利诺伊芝加哥 60611)

基础医学研究

淫羊藿苷对Tg2576小鼠学习记忆功能及海马神经细胞再生的影响*

蔡 锐1，李 菲1，董红心1，2，石京山1

(1.遵义医学院药理学教研室基础药理省部共建教育部重点实验室，贵州遵义 563099;2.美国西北大学精神病学与行为科学实验室，伊利诺伊芝加哥 60611)

目的观察淫羊蕾昔对Tg2576小鼠学习记忆功能及海马齿状回神经细胞再生的作用。方法Tg2576转基因小鼠及野生型小鼠分为4个组:野生型对照组、野生型+淫羊蕾昔组、Tg2576对照组和Tg2576+淫羊蕾昔组。给药组灌胃淫羊蕾昔60 mg/kg/d，对照组灌胃同体积蒸馏水，每天1次，连续3个月。Morris水迷宫检测动物行为学改变;硫黄素S染色检测海马组织内老年斑;免疫组织化学法检测海马齿状回BrdU+细胞;Western blot检测海马组织淀粉样前体蛋白(APP)和脑源性神经营养因子(BDNF)的蛋白表达。结果淫羊蕾昔明显缩短Tg2576小鼠水迷宫逃避潜伏期和搜索距离;明显减少海马组织内的老年斑;增多海马齿状回BrdU+细胞数量;降低海马组织APP高表达和改善BDNF低表达状态。而野生型小鼠给予淫羊蕾昔3个月后，上述指标没有显著变化。结论淫羊蕾昔改善Tg2576小鼠空间学习记忆功能，并促进海马齿状回神经细胞再生。

淫羊藿普;学习与记忆;神经再生;Tg2576小鼠;淀粉样前体蛋白;脑源性神经营养因子

淫羊蕾昔是贵州省道地中药材淫羊蕾的主要活性成分之一，具有广泛的药理作用，其中神经保护作用颇受关注。本实验室研究表明，淫羊蕾昔可通过抗氧化、抗炎及增加神经营养因子等作用改善阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)模型大鼠的学习记忆功能［1-3］。AD为临床常见疾病［4］，主要表现为记忆和认知功能的丧失。AD的主要病理变化为细胞外老年斑和细胞内神经原纤维缠结，以及部分脑区神经元丢失，如海马及皮层。神经营养因子及脑源性神经因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)具有促进海马及嗅球神经元再生的作用，通过脑内灌注外源性BDNF或者诱导内源性BDNF可增加神经元再生及存活［5-6］。淫羊蕾昔是否通过增加BDNF而促进AD大脑神经再生，尚不清楚。因此，本研究采用AD转基因模式小鼠(Tg2576)首先判断淫羊蕾昔对该模式小鼠学习记忆功能的影响，同时观察淫羊蕾昔对该小鼠海马齿状回神经再生的影响。

1 材料与方法

1.1 供试材料和仪器 Tg2576小鼠及同龄野生型小鼠由美国西北大学董红心实验室提供;Morris水迷宫(ANY-Maze)购自美国Stoelting公司;Leica荧光显微镜(DM4000B)购自德国Leica公司; Western blot及全自动凝胶图象分析仪(Chemi Dos Xps)购自美国BIO-RAD公司。受试药淫羊蕾昔购于南京泽朗医药技术有限公司，经HPLC测定纯度≥98%。

1.2 试验方法

1.2.1 分组及给药 Tg2576及野生型小鼠分为4个组:野生型小鼠对照组、野生型+淫羊蕾昔组、Tg2576对照组、Tg2576+淫羊蕾昔组，每组10只。自8月龄始灌胃给予淫羊蕾昔60 mg/kg/d，对照组小鼠给予同体积蒸馏水灌胃，每天1次，连续灌胃3个月。给药结束前16 d，每组取4只小鼠腹腔注射BrdU 50 mg/kg/d，末次注射2 h后处死动物收集大脑组织。

1.2.2 空间学习及记忆能力检测 所有小鼠在给药结束前5 d进行行为学测试。采用Morris水迷宫对小鼠进行4 d的定位航行实验，第5天行空间探索以判断小鼠的空间记忆能力。

1.2.3 组织学观察 小鼠行深麻醉及透心灌注后取脑作35μm的冰冻切片，每4张脑切片选取1张，每只动物大约15～20张。1%的硫黄素S染色后荧光显微镜观察老年斑形成情况。免疫组织化学法标记光学显微镜观察5-溴-2-脱氧尿嘧啶核昔(5-Bromo-2-deoxyUridine，BrdU，美国Sigma-Aldrich公司)阳性细胞及数量，计数的BrdU阳性细胞定位在海马齿状回颗粒细胞层内或细胞下层不超过细胞直径的2倍距离，每张片子选取4个视野计数，并计算每张切片的平均BrdU阳性细胞数量。

1.2.4 Western blot检测 提取小鼠海马组织总蛋白，经PAGE胶分离转至PVDF膜，再采用APP (美国Santa Cruz公司)和BDNF(美国Santa Cruz公司)抗体观察蛋白表达情况。采用BeyoECL(美国Thermo公司)化学发光显影，Quantity One定量分析系统对印迹进行半定量分析。

1.3 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件进行分析，结果以均数±标准差(±s)表示，水迷宫数据采用重复测量数据方差分析(RM-ANOVA)，其余资料采用单因素ANOVA，有差异者采用LSD法进行后续分析，P＜0.05认为有统计学意义。

2 结果

2.1 淫羊藿普对Tg2576小鼠的空间学习记忆能力的影响 定位航行实验显示，逃避潜伏期和搜索距离均随着训练时间的推移而缩短。经4 d训练后结果显示，时间与分组没有交互作用，说明该指标随时间变化的现象与分组无关。分组因素在第3天和第4天出现差异(见图1)，表现为Tg2576小鼠逃避潜伏期和搜索距离较野生型小鼠明显延长，淫羊蕾昔可缩短Tg2576小鼠逃避潜伏期和搜索距离，但不改变野生型小鼠的逃避潜伏期和游泳距离。由此可得，淫羊蕾昔对Tg2576小鼠空间学习能力具有改善作用。

第5天空间探索结果显示(见图2)，Tg2576小鼠在原平台象限停留的时间［F(3，36)=3.750，P=0.019］及原平台象限游泳距离百分比［F(3，36)=4.019，P=0.014］明显下降，提示Tg2576小鼠空间记忆能力明显减弱，淫羊蕾昔可改善这一现象，但对野生型小鼠没有明显影响。

图1 淫羊藿苷对小鼠定位航行结果的影响

图2 淫羊藿苷对小鼠空间探索结果的影响

2.2 淫羊藿普对Tg2576小鼠海马组织中老年斑的影响 为研究淫羊蕾昔对老年斑的影响，本实验采用了硫黄素S染色荧光显微镜观察。因野生型小鼠脑内无Aβ沉积形成的老年斑［7］，故该检测没有设野生型对照组。结果显示Tg2576小鼠海马组织内形成大量老年斑，并融合成团。给予淫羊蕾昔3个月后，Tg2576小鼠海马组织内老年斑的显著减少，提示淫羊蕾昔能够减少Tg2576小鼠海马组织中Aβ的沉积(见图3)。

图3 淫羊藿苷对Tg2576小鼠海马组织中老年斑的影响

2.3 淫羊藿普对Tg2576小鼠海马齿状回神经细胞再生的影响 采用BrdU标记新生细胞数量，观察小鼠海马齿状回神经细胞再生的情况。野生型小鼠给予淫羊蕾昔后，BrdU+细胞数没有明显变化。Tg2576小鼠海马齿状回BrdU+细胞较野生型明显减少，提示Tg2576小鼠神经再生功能低下;给予淫羊蕾昔后，BrdU+细胞数目明显增加［F(3，10)=3.877，P=0.045］，说明淫羊蕾昔可刺激Tg2576小鼠海马齿状回神经细胞再生(见图4)。

图4 淫羊藿苷对小鼠海马齿状回神经细胞增殖的影响

2.4 淫羊藿普对小鼠海马组织APP和BDNF蛋白表达的影响 淫羊蕾昔能减少海马组织中Aβ沉积形成的老年斑，为判断其原因是否与Aβ产生的源头APP减少有关，因此检测了海马组织APP的蛋白表达。结果如图5所示［F(3，12)=5.760，P=0.011］，给予淫羊蕾昔3个月后能显著减少Tg2576小鼠海马组织APP的蛋白表达，但对野生型小鼠的APP蛋白表达没有影响。

图5 淫羊藿苷对小鼠海马APP和BDNF蛋白表达的影响

为判断淫羊蕾昔对神经再生的促进作用是否与其促进神经再生的营养因子高表达相关，本试验观察了BDNF的蛋白表达，结果如图5所示［F(3，12)=3.594，P=0.046］，给予淫羊蕾昔3个月后能显著增加Tg2576小鼠海马组织BDNF的蛋白表达，但对野生型小鼠的BDNF蛋白表达没有影响。

3 讨论

本实验采用Tg2576模式小鼠观察了贵州省道地中药材淫羊蕾的主要有效成分之一淫羊蕾昔抗AD的作用。Tg2576小鼠高度表达人APP695，9月龄时出现Aβ沉积、行为缺陷等类AD样表现［8］。所以本实验自8月龄开始给药，至11月龄观察药物效果。水迷宫定位航行和空间探索结果显示，淫羊蕾昔明显改善Tg2576模式小鼠空间学习和记忆能力。

AD脑内特征性病理表现之一是老年斑，由Aβ在细胞外沉积形成。Aβ由其前体蛋白APP经过分泌酶剪切产生，这些物质过度增多均与学习记忆和认知功能的减退相关［9］。本实验结果显示，淫羊蕾昔减少Tg2576小鼠海马组织内老年斑的形成及APP的蛋白表达;前期结果表明，淫羊蕾昔可减少APP/PS1小鼠脑组织Aβ40/42的含量及APP水平［10］，综合结果提示淫羊蕾昔可减少APP，从而减少Aβ含量，并且减少Aβ在脑内的沉积。

Lazarov等［11］的实验结果显示，脑内出现明显淀粉样蛋白沉积的AD小鼠海马齿状回细胞增殖能力明显降低，表明神经再生能力降低与学习记忆具有相关性。也有研究表明，成年哺乳动物脑内新生的神经元可促进认知功能改善［12-13］。本实验结果确证了淫羊蕾昔对Tg2576模式小鼠空间学习记忆能力的改善作用，同时证明淫羊蕾昔具有刺激该模式小鼠海马齿状回神经再生的作用。为探索淫羊蕾昔促进神经再生的作用机制，观察了海马组织中BDNF的蛋白表达。BDNF在哺乳动物神经元的分化、存活和突触可塑性中起着重要作用，而且还具有抵抗AD脑中Aβ神经毒性的作用［14-15］。早有结果显示，BDNF可促进海马齿状回颗粒细胞的产生，成年大鼠海马组织灌注外源性BDNF后，观察到BrdU+细胞数明显增多［16］。本研究显示淫羊蕾昔增加BDNF的蛋白表达，提示淫羊蕾昔促神经再生可能与增加BDNF的表达有关。

综上所述，淫羊蕾昔改善Tg2576模式小鼠空间学习及记忆能力，可能与降低APP蛋白的高表达、减少Aβ沉积形成的老年斑有关;淫羊蕾昔并可通过增加内源性BDNF而促进Tg2576模式小鼠海马齿状回神经再生。提示淫羊蕾昔抗AD作用是多方面共同调节的结果。

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［收稿2015-06-08;修回2015-07-09］

(编辑:王 静)

Effects of icariin on the learning and memory function and hippocam pus neurogenesis of Tg2576 m ice

Cai Rui1，Li Fei1，Dong Hongxin1，2，Shi Jingshan1
(1.Department of Pharmacology and Key Laboratory for Basic Pharmacology of Ministry of Education，Zunyi Medical University，Zunyi Guizhou 563099，China;2.Laboratory of Psychiatry and Behavioral Sciences，Northwestern University，Chicago Illinois 60611，USA)

Objective To observe the effects of icariin on the learning and memory function and neurogenesis in the dentate gyrus(DG)of hippocampus in Tg2576mice.M ethods Tg2576mice and wild typemicewere divided into four groups:wild type control group，wild type+icariin group，Tg2576 control group，and Tg2576+icariin group.Icariin-treated mice were administrated with 60 mg/kg/d icariin by gavage.Wild type and Tg2576 mice were given equally volume distilled water，once a day，for 3 months.Morris water maze was used to test the learning and memory function ofmice.Senile plaques(SPs)in the hippocampus of Tg2576 mice were observed by thioflavine Sstaining.The number of BrdU+cells in the DG of hippocampuswas detected through immunohistochemical staining.The protein expressions of amyloid precursor protein(APP)and brain derived neurotrophic factor(BDNF)were assayed by western blot.Results Icariin not only significantly reduced the latency and distance of Tg2576 mice in watermaze，decreased SPs in the hippocampus of Tg2576 mice，increased the number of BrdU+cells in the DG of hippocampus，but also reduced the expression of APP and elevated the expression of BDNF in the hippocampus of Tg2576 mice.However，the above parameters did not change in icariin-treated wild typemice.Conclusion Icariin improves the function of learning and memory of Tg2576 mice，and promotesneurogenesis in the DG of hippocampus.

icariin;learning and memory;neurogenesis;Tg2576 mice;amyloid precursor protein;brain derived neurotrophic factor

R285

A

1000-2715(2015)04-0350-05

国家重点基础研究发展计划(973计划)前期研究专项(NO:2011CB512009);贵州省科技厅联合基金(NO:黔科合J字LKZ［2013］12)。

石京山，男，教授，博士，博士生导师，研究方向:神经药理，E-mail:shijs@zmc.edu.cn。