一种共沉淀回收构建载体的新方法

孔 昆，陶 园，朱宏波(广东海洋大学农学院，广东湛江524088)

在基因工程和分子生物学研究中，载体构建是一种常用的技术［1－2］，传统载体构建方法需要进行双酶切得到目的片段和目标载体，再通过琼脂糖凝胶电泳进行切胶回收、连接、转化。随着载体构建技术的研究深入，人们开发出了多种方法来快速构建载体。邝翡婷等［3］利用重组融合PCR的方式快速获得一些阳性克隆;欧阳平等［4］利用添加同源序列并通过一步克隆的方法也成功构建了4个载体;陆云华等［5］利用定点表达载体pRSMGA对水稻多片段进行拼接，提供了一种通用、有效构建复杂载体的方法。而由Invitrogen公司开发的基因克隆Gateway技术可以快速、高效地将目的基因同时构建到多种与其兼容的载体系统中，可进行基因的蛋白质表达和功能分析［6－7］。而传统载体构建过程中，切胶回收方法的优点是可以清楚切取目标条带，排除其他因素对连接的干扰;但由于酶切最适时间确定困难或手工切胶造成的误差，使得载体构建的难度非常大。笔者利用乙醇可以使酶切反应中的内切酶变性失活的特性对酶切产物进行回收和纯化［8］，再将得到的混合沉淀溶解进行连接、转化，从而快速获得了阳性克隆，载体构建成功。

1 材料与方法

1.1 材料 pCambia1301质粒由广东海洋大学农学院分子植物育种实验室保存;PTD-cry3Aa基因由上海生工生物工程股份有限公司合成连接在pUC57载体上;大肠杆菌(DH5α)感受态细胞由笔者制备。

1.2 植物表达载体的构建 植物表达载体pCambia1301，大小12 kb，多克隆位点上游带有CaMV35S启动子，下游带有GUS报告基因，可进行Kanamicin抗性筛选。而pUC57质粒上则带有目的基因cry3Aa，cry3Aa基因是苏云金芽孢杆菌抗鞘翅目昆虫的一类杀虫基因，全长1 989 bp。利用BamHI和SalI双酶切带有cry3Aa基因片段的pUC57质粒，协下的Cry3Aa基因片段连接到同样由Bam HI和SalI 2种酶协割后的载体pCambia1301上，构建植物表达载体pCambia1301-cry3Aa(图1)，将其转化至大肠杆菌DH5α，按常规方法提取质粒，进行PCR反应及酶切鉴定。其具体操作见图1。

1.2.1 植物表达载体pCambia1301-cry3Aa酶切及回收。酶切反应体系:pCambia1301 20 μl+Buffer(H)5 μl+BamHI 0.5 μl+SalI 0.5 μl+ddH2O 24 μl;pUC57 30 μl+Buffer(H)5 μl+BamHI 0.5+SalI 0.5 μl+ddH2O 14 μl，2 种酶切体系的反应体积均为50 μl，37℃下酶切6 h。待酶切结束后将酶切产物pCambia1301和pUC57-cry3Aa进行混合，加入2倍体积冰冻的无水乙醇和1/10体积的3 mol/L醋酸钠，冰冻15 min，12 000 r/min离心5 min，沉淀即为回收片段。

1.2.2 植物表达载体pCambia1301-cry3Aa连接及转化。目的片段与pCambia1301载体的连接体系为:沉淀产物28 μl+T4DNA Ligase 2 μl+DNA Ligase Buffer 3.5 μl+ddH2O 1.5 μl。16℃连接12 h，连接过夜的产物10 μl加入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，转化方法为热激转化法，具体步骤:10 μl连接产物加入到100 μl感受态细胞中→冰浴30 min→42℃热激85 s→冰置2 min→加入890 μl不含抗生素的LB液体培养基，37℃，200 r/min，45 min→4 ℃，8 000 r/min，30 s→弃 850 μl上清液，沉淀混匀，剩余菌液涂布到含50 mg/L卡那霉素的LB固体培养基中，37℃培养16～20 h后观察菌落数。

1.3 植物表达载体pCambia1301-cry3Aa检测

1.3.1 PCR检测。根据GenBank公布cry3Aa基因序列，应用Primer Premier 6.0软件分析设计一对检测引物，上游引物序列为:5'ACAACAGATGAACCTCTTGA 3'，下游引物序列为:5'CGAATGGTGTGCTGAAAC 3'。可扩增出463 bp的片段，引物由上海Sangon合成。PCR反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环;72℃延伸7 min。

1.3.2 酶切检测。经过PCR扩增后得到的阳性条带，提取对应质粒，再用BamHI和SalI进行双酶切。

2 结果与分析

2.1 载体酶切及沉淀 对BamHI和SalI酶切产物进行鉴定，结果见图2，由图2可知，pCambia1301质粒和pUC57－cry3Aa分别得到12 000、2 700、2 000 bp载体片段，与预计目标条带大小一致;将2个酶切产物进行混合共沉淀回收得到3条清晰条带，由上至下分别为pCambia1301、pUC57、cry3Aa，其大小与酶切结果一致(图3)。

2.2 植物表达载体的PCR鉴定 获得21个转化子(图4)经菌落PCR发现，8、9两孔可以扩增出长463 bp左右的片段，与阳性对照一致，而阴性对照(空白)却未见该目的条带(图5)，其阳性率达10%。

2.3 植物表达载体的酶切鉴定 用BamHI和SalI双酶切鉴定pCambia1301-cry3Aa质粒，酶切得到12 000 bp pCambia1301载体和2 000 bp cry3Aa的片段，与预期大小一致;经过2次鉴定说明该植物表达载体构建成功(图6)。

3 结论与讨论

伴随着植物基因工程技术的日益完善，植物表达载体构建将会以更加迅猛的趋势发展，发展方向则是操作更加简便，适用范围更加广泛，且更加经济、有效。发展的大方向则是多种方法与 Gateway技术结合应用［9－10］。该研究表明，对比传统的酶切产物切胶回收以及另外几种相对成熟的载体构建技术，酶切产物沉淀回收的方法是一种经济、简易、快捷的载体构建方法;其经济体现在:混合沉淀回收的方法省去购买试剂盒的费用，节省了财力;其简易体现在:回收的方法省去切胶回收繁琐的步骤，使构建过程更加快速。虽然混合沉淀回收过程中会造成载体自连，目的基因与非目标载体连接的情况，但操作简单易行，对下一步连接试验没有任何影响［11］，且得到的菌落经过菌液PCR基本可以去除假阳性的干扰，鉴定过程并不繁琐;且该方法的阳性率可达10%以上，因此，该方法是一种非常有效的载体构建方法，对于今后实验室载体构建提供一种新的思路，更为今后的科研节省了成本，具有重要的经济意义。

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