桉树无性系雷11组织培养技术研究

杨卫星，卢开成，安冰(广西国有派阳山林场，广西宁明532500)

桉树(Eucalyptus)为桃金娘科(Myrtlefamily)桉属常绿高大乔木，原产地大多数在澳大利亚［1］。桉树喜光好湿、耐旱畏寒、抗热抗病，因其生长迅速、适应性强、技术成熟、用途广泛且经济效益优良，而被世界上百余个国家和地区广泛引种栽培，是世界著名的三大速生树种之一。桉树引种我国已有百年历史，在我国林业发展中占有举足轻重的地位［2］。建立桉树组织培养与再生系统，既可为商品化大规模育苗做准备，又有助于建立转基因系统，为利用转基因手段改良桉树性状奠定良好的基础［3］。

1 材料与方法

1.1 试验材料 所采用桉树无性系雷11(E.leizhou No 11)为材料，雷11是雷州林业局研究开发的优良无性系，具有生长迅速、抗病性强等特点［4］。

1.2 试验方法 外植体的取材与灭菌:选用三年生桉树半木质化萌发茎段为外植体，取材时间宜天气晴朗3 d后，10:00～15:00采集萌芽条，材料用饱和洗衣粉溶液刷洗干净后备用。外植体消毒采用2个处理:①75%乙醇30 s+0.1%氯化汞7 min;②15%新洁尔灭30 min+10%次氯酸钠10 min，灭菌后的材料切成1～2 cm长的茎段，每段带1个节接种到培养基上，置于光强3 000 lx、温度25℃诱导不定芽。外植体诱导培养基分别设3个处理:①MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L;②MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.4 mg/L;③MS+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.3 mg/L。

增殖培养基分别设3个处理:①MS+6-BA 0.7 mg/L+NAA 0.35 mg/L;②MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.25 mg/L;③MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.15 mg/L。培养条件:温度24～26 ℃，光照12～14 h/d，光强2 500～3 000 lx。

生根培养基分别设3个处理:①1/2MS+IBA 0.3 mg/L+ABT1 0.6 mg/L;②1/2MS+IBA 0.2 mg/L+ABT 10.4 mg/L;③1/2MS+IBA 0.1 mg/L+ABT 10.2 mg/L。培养条件:温度24～26 ℃，光照12～14 h/d，光强3 000～3 500 lx。

2 结果与分析

2.1 外植体的取材与灭菌 由表1可知，灭菌方式②比①萌芽率高13%，灼伤率低13%，灭菌后的外植体生长较好、萌发较快，有一定优势，但污染率较①高16%。这说明处理①可以有效降低外植体的污染率，但对外植体起到明显的伤害作用，易出现褐化，导致其死亡。试验中还发现使用10%次氯酸钠灭菌时，将10 min灭菌过程分成2次5 min灭菌过程(中间使用无菌水清洗数次)，对黄化、白化现象有一定抑制作用，且灭菌效果不变。以后的试验中，均以处理②为消毒方式。

表1 2种外植体消毒方式对比

2.2 桉树组织培养体系的建立

2.2.1 诱导培养基。由表2可知，诱导培养基的激素浓度以处理②效果最佳，增殖倍数适宜，达到2～3个芽，芽的长势及状态良好，萌芽率高，生长较快;处理①激素浓度过高，萌芽率较②低8%，且出现褐化玻璃化，难以驯化，即使很快扩大繁殖，也会成为无效芽;处理③激素浓度偏低，萌芽率较②低17%，芽质量好，但生长慢，数量少，降低了扩繁速度，对育苗生产进度有所影响。

2.2.2 增殖培养基。由表3可知，增殖培养基的激素溶度以处理②效果最佳，增殖倍数适宜，达到3.96 cm，芽的长势及状态良好，生长旺盛，茎粗叶厚;处理①激素浓度过高，增殖个数较②低58.9%，生长较弱，芽点过密，基部易形成愈伤团块;处理③激素浓度偏低，萌芽率较②低52%，茎叶细长，长势变弱。即处理②为最佳增殖培养基。

表2 不同外植体诱导培养基对比

表3 不同外植体增殖培养基对比

2.2.3 生根培养基。由表4可知，生根培养基的激素浓度以处理②效果最佳，接种21 d后，根系发达，达到7.45 cm，侧根繁多，苗木生长旺盛，长势均一，移栽后成活率可达95%;处理①激素浓度过高，苗高较②低73.4%，根长较②低55.7%，生根率低，易出现培养基褐化、根基部膨大现象，部分不生根，苗木较弱，长势参差不齐，移栽后长势较弱，成活率低;处理③激素浓度偏低，苗高较②低68.2%，根长较②低68.3%，生根率低，根系较弱，侧根少，苗木生长缓慢，细弱，长势参差不齐，移栽后成活率低，生长较慢。

表4 不同生根培养基对比

3 结论与讨论

外植体采集后，饱和洗衣粉水刷洗干净的预处理方法效果最佳。采集后及时进行清洗消毒并接种到诱导培养基中，可极大减少剪口被病菌污染几率，保持枝条的活性，从而降低污染率，提高萌芽率，达到事半功倍的效果。外植体消毒使用乙醇和氯化汞消毒一次的污染率最低，但易灼伤苗木，出现培养基褐化现象;新洁尔灭和次氯酸钠污染率次之，但基本无灼伤，萌芽率高，萌发较快。实际操作时，要注意细节，掌握要领，动作干净利落，可有效地降低污染率，这与其他桉树外植体研究类似［5］。

不同浓度激素对外植体诱导有显著影响，处理②为最佳培养基配方，接种7～10 d后芽开始萌动，12 d左右基部有绿色突起出现，20～25 d诱导出芽。试验中发现，激素浓度过高，易发生畸形并形成白色松散的愈伤组织，浓度过低，又影响萌动，这与相思树等其他树种的组织培养有相似性［6］。在增殖培养时，激素浓度过高，也会出现畸形、玻璃化等现象，处理②为最佳配方，可得到最多的有效芽。

在工厂化生产中，要掌握好暗培养、弱光培养及自然光培养的时间，才能够获得生长健壮、增殖倍数适宜的无菌芽，建立有效的无菌芽繁殖体系，生产出合格的苗木，在类似文献中，也得到了同样的结论［5］。

在生根培养试验中，处理②为最佳配方，接种3 d后芽基部开始形成根原基突起，5～6 d后出现小根，19～21 d后长出发达的根系，侧根多而密，移栽成活率高。桉树的根系发育是一个喜光过程，尤以自然光最佳，根系发育良好的同时，茎叶发育也很健壮，且培育后期木质化程度好，可大幅度提高移栽后成活率。在工厂化生产中，如何减轻茎段基部褐变是生根研究的关键之一［7－8］，为了抑制培养基褐化，可适当加入抗坏血酸(0.01～0.02 mg/L为宜)和活性炭(40 mg/L为宜)，加入过少无法抑制褐化，加入过量则容易影响到pH。

无菌芽诱导和无菌体系的建立，是一个复杂艰难的过程，是最核心的技术环节。随着桉树种植的不断发展，组培培养技术不断取得新的突破和进展［9］，如何加快诱导速度、缩短培养周期、降低生产成本，特别是优良无性系的选育推广，都有待更多的试验和研究。

［1］祁述雄.中国桉树［M］.2 版.北京:中国林业出版社，2002.

［2］祁述雄.中国引种桉树与发展现状［J］.广西林业科学，2006，35(4):250－252.

［3］谢耀坚.桉树组培培养研究进展［J］.世界林业研究，2000，13(6):14－16.

［4］黄宏林，陈马兴，何普兴，等.桉树枝瘿姬小蜂危害对无性系雷11的影响［J］.桉树科技，2013，30(2):26 －28.

［5］邓海群，莫继有，玉首杰，等.尾巨桉家系外植体诱导技术［J］.桉树科技，2011，28(1):27 －29.

［6］蔡玲，王以红，吴幼媚，等.五种相思树组织培养研究［J］.广西林业科学，2003，32(1):27 －29.

［7］郭洪英，陈炙，杨晓蓉，等.影响桉树组培苗根系发育关键因子的研究［J］.四川林业科学，2008，29(1):20 －26.

［8］欧阳晶.桉树组培快繁中存在的问题与对策［J］.福建林业科技，2006，33(1):203－206.

［9］杨民胜，李天会.中国桉树研究现状与科学经营［J］.桉树科技，2005，22(2):1－6.