丹瓜方对糖尿病大鼠离体心脏灌注的影响研究
2015-12-21杨柳清衡先培陈依楚李亮
杨柳清,衡先培,陈依楚,李亮
(1.福建中医药大学附属人民医院,福建福州350004;2.广州中医药大学,广东广州510006)
丹瓜方对糖尿病大鼠离体心脏灌注的影响研究
杨柳清1,衡先培1,陈依楚2,李亮1
(1.福建中医药大学附属人民医院,福建福州350004;2.广州中医药大学,广东广州510006)
目的探讨丹瓜方对糖尿病大鼠离体心脏灌注的影响。方法选取SD大鼠,糖尿病造模成功后随机分为模型组、糖脉康组和丹瓜方低、中、高剂量组,糖耐量正常的SD大鼠为正常组。12周后查糖耐量试验(OGTT)、糖化血红蛋白(HBA1C)、血脂,并用Langendorff灌流装置灌注离体心脏,记录不同时点心率、心肌收缩幅度值及冠脉流量。结果与模型组比较,丹瓜方各组、糖脉康组FBG、HbA1C、TC降低(P<0.01);丹瓜方中剂量组1 h-PG、低剂量组2 h-PG降低(P<0.01),中、高剂量组TG水平降低(P<0.01);第5 min,低、中剂量组心率增加(P<0.01),丹瓜方各组心肌收缩幅度增加(P<0.01);第10 min,低、中剂量组心率增加(P<0.01),低剂量组心肌收缩幅度增加(P<0.01);第15 min,低剂量组心率增加(P<0.01),第30 min,低、中剂量组心率增加(P<0.05或<0.01);第15、20、30 min,丹瓜方各组、糖脉康组心肌收缩增加(P<0.05或<0.01)。结论丹瓜方不仅可改善糖脂代谢,而且可增加心肌收缩力,改善心功能。
糖尿病;慢性心力衰竭;心脏灌注;痰瘀同治;丹瓜方
糖尿病是慢性心力衰竭的独立危险因素,约30%的糖尿病患者合并慢性心力衰竭[1]。糖尿病合并慢性心力衰竭的死亡率明显高于一般人群,3年死亡率达40%,是非糖尿病患者的2倍[2]。糖尿病合并心力衰竭早期可呈无症状性舒张功能障碍,后期可累及心脏收缩功能,发生充血性心力衰竭,甚至心率失常、心脏猝死等,病情往往较复杂,治疗较困难。前期研究表明:痰瘀同治丹瓜方对糖尿病患者具有改善糖脂代谢[3-6],消除高糖的细胞毒性[7],恢复高糖中细胞生长的正常周期[8-9],下调氧化应激,抗动脉粥样硬化,保护血管功能[10-11]等作用。本研究采用丹瓜方对2型糖尿病模型大鼠进行干预,观察其对离体心脏灌注时心率、心肌收缩幅度、冠脉流量的影响。
1 材料
1.1 实验动物健康清洁级SD雄性大鼠,8周龄,体重(220±10)g,均购于上海斯莱克实验动物有限责任公司,分笼饲养于福建中医药大学动物实验中心SPF级动物房内。动物房内饲养情况,温度:(22±1)℃;湿度:50%±5%;12/12 h明暗周期。
1.2 实验药物与试剂丹瓜方是我院基于前人的临床经验,结合多年的糖尿病临床工作经验创立的,该方由四物汤和瓜蒌薤白半夏汤化裁而来,由丹参、瓜蒌、川芎、薤白、赤芍等组成,按原生药浓度分为1 g/mL、2 g/mL、3 g/mL 3种规格,制剂由福建中医药大学附属人民医院药剂科配制,批准文号:闽药制字Z20150008。糖脉康颗粒,四川升和药业有限公司生产,批号:国药准字Z10970026。主要实验试剂:STZ试剂,美国Simga公司;75%乙醇,天津达森化工产品销售公司;生理盐水,福州海王福药制药有限公司;PBS磷酸盐缓冲液,赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司。
1.3 主要实验仪器与设备Langendorff离体心脏灌流装置,北京众实迪创业有限公司;SIM-F140制冰器,日本三洋公司;BCD 518WS A医用冰箱,青岛海尔股份有限公司;DK600S三用水浴恒温箱,上海精宏实验设备有限公司;拜安捷2血糖检测试碟(葡萄糖氧化酶法),拜耳医药保健有限公司;Milli-Q Advan-tageA10超纯水系统,美国MILLIPORE公司;博唐平A1CEZ糖化血红蛋白检测试纸,无锡博慧斯生物医药科技有限公司。
2 实验方法
2.1 造模方法选取SD大鼠45只,于早上8点撤去大鼠食物,禁食不禁水,12 h后测量大鼠空腹状态的体重,连续3 d。将3次体重取平均值,计算出每只大鼠的空腹体重。将体重值由高到低排列,用随机数字表法分取正常大鼠10只,饲以普通饲料。其余35只大鼠饲以高脂饮食饲养4周后(普通饲料87.63%、精炼猪油10%、胆固醇2%、猪胆盐0.3%、丙基硫氧嘧啶0.07%,由福建省医学科学研究所实验动物中心提供),禁食不禁水,12 h后测量大鼠空腹状态的体重,连续3 d。将3次体重取平均值,计算出每只大鼠的空腹体重,并按照30 mg/(kg·d)计算出大鼠造模每日所需链脲佐菌素(STZ)注射量。于大鼠空腹状态下行腹腔注射STZ,每日注射,连续注射2 d,于第2次STZ注射结束后的48 h及72 h检测FBG。选取出2次FBG均≥11.1 mmol/L大鼠,视为糖尿病模型造模成功,最终成模率为100%。
2.2 分组及干预方法将已成模的SD大鼠按体重分层,按FBG水平由高到低排序,根据随机数字表法分为模型组[无菌水,17.1 mL/(kg·d)]、糖脉康组[糖脉康,17.1 mL/(kg·d)]、低剂量丹瓜方组(1 g/mL丹瓜方药液)、中剂量丹瓜方组(2 g/mL丹瓜方药液)、高剂量丹瓜方组(3 g/mL丹瓜方药液),均按17.1 mL/(kg·d)配制。每组7只。以上药物用量均为50 kg成人每日常规用药量5倍灌胃给药。在干预过程中,高剂量丹瓜方组中1只大鼠因灌胃操作失误而导致死亡。正常组即为先前已分取的健康SD大鼠,选取糖耐量正常的大鼠7只。各组糖尿病模型大鼠均饲以相同的高脂饲料喂养,正常组以普通饲料喂养。均于每日上午9点灌胃给药,连续干预12周后,禁食不禁水12 h取标本。
2.3 检测指标及方法干预第12周查糖耐量试验、糖化血红蛋白、血脂。12周药物干预期结束后,腹腔注射肝素钠溶液,进行肝素化20 min后,再以腹腔注射10%水合氯醛麻醉(0.5 mL/100 g),待大鼠麻醉后,用手术剪迅速打开胸腔,充分暴露心脏,迅速将心脏分离,置于4℃改良Krebs-Henseleit(KH)液中洗净血液,剪去肺组织、食道等多余组织,留胸断主动脉长度约3cm,逆行插管,后迅速转移,将胸段主动脉固定于Langendorff灌流装置,以改良K-H液行恒流恒温(泵速7.0,水浴循环37.0℃)灌流。改良K-H液成分如下(g/L):NaCl 6.896,KCl 0.35,K2HPO40.163,MgSO4·7H2O 0.296,NaHCO32.10,CaCl20.139,葡萄糖1.982,PH 7.3~7.4,通以95% O2+5%CO2混合气体饱和,维持灌流液温度37℃。待心脏搏动稳定10 min后,通过生物信号采集系统分别记录第5、10、15、20、30 min的心率、心肌收缩幅度值、冠脉流量。
2.4 统计学处理用SPSS 20.0统计软件,计量资料用t检验,属正态分布者用x±s表示。多样本均数两两比较采用单因素方差分析,方差齐采用LSD,方差不齐者经对数转换,使方差齐后再用LSD比较。P<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 各组血糖和HbA1C比较见表1。
表1 各组血糖和HbA1C比较(±s)
表1 各组血糖和HbA1C比较(±s)
注:与正常组比较,1)P<0.01;与模型组比较,2)P<0.01。
干预前干预后组别数目剂量正常组模型组糖脉康组低剂量组中剂量组高剂量组7 7 7 7 7 6—SW 0.091 g/mL TMK 1 g/mL DG 2 g/mL DG 3 g/mL DG FBG/(mmol/L)—20.44±4.96 21.86±5.02 21.04±4.57 20.06±5.29 21.84±4.84 FBG/(mmol/L)6.07±0.31 22.67±4.391)12.87±4.332)9.29±5.102)8.16±2.682)13.81±4.312)OGTT 1h-PG/(mmol/L)8.33±1.23 27.07±2.621)26.01±3.60 24.96±2.36 23.70±3.242)27.54±2.99 OGTT 2h-PG/(mmol/L)7.19±2.20 27.46±1.841)27.07±1.15 23.83±2.402)26.63±1.05 26.80±1.17 HbA1C/% 4.86±0.24 9.74±0.381)7.47±0.322)7.69±0.272)6.63±0.272)6.93±0.312)
3.2 干预12周后各组TC及TG比较见表2。
表2 干预12周后各组TC及TG比较(±s)mmol/L
表2 干预12周后各组TC及TG比较(±s)mmol/L
注:与正常组比较,1)P<0.01;与模型组比较,2)P<0.01。
组别正常组模型组糖脉康组低剂量组中剂量组高剂量组n 7 7 7 7 7 6剂量—SW 0.091 g/mL TMK 1 g/mL DG 2 g/mL DG 3 g/mL DG TC 1.14±0.28 3.06±0.251)2.40±0.642)2.22±0.392)2.24±0.282)2.43±0.432)TG 1.29±0.30 2.46±0.701)2.03±0.47 2.09±0.49 1.70±0.702)0.78±0.262)
3.3 各组离体心脏灌注时心率比较见表3。
3.4 各组离体心脏灌注时心肌收缩幅度比较见表4。
3.5 各组离体心脏灌注时冠脉流量比较见表5。各组比较无显著性差异(P>0.05)。
4 讨论
目前认为糖尿病由于糖、脂代谢紊乱,导致心肌缺血、缺氧、心肌细胞凋亡或坏死,使心脏微血管内皮细胞增生、基底膜增厚、氧利用率降低、纤维组织增生、糖基化蛋白、甘油三酯及胆固醇在心肌间质沉聚是糖尿病合并心力衰竭发生发展的核心病理生理基础[12]。Tebpe[13]研究表明:将正常大鼠心肌细胞置于高糖环境中培养24 h后,大鼠心肌细胞心肌细胞收缩力下降、舒张期延长。Meyers[14]研究表明糖尿病心脏舒张功能受损的严重程度与糖化红蛋白水平有关。本次研究采用Langendorff离体心脏灌流技术体外观察并评估各组大鼠的心率、心肌收缩幅度及冠脉流量,研究结果表明:在时长为30 min的灌流期内,与正常组相比,各糖尿病模型鼠组的心率、收缩幅度皆处于一个较低的水平,说明糖尿病模型大鼠在病程中,心肌的收缩、搏动发生了不同程度的功能障碍,亦佐证心脏是糖尿病并发症的靶器官。糖尿病因心肌细胞功能障碍与结构改变,导致心肌顺应性降低,心脏舒张及收缩功能受限。
表3 各组大鼠各时间点心率比较(±s)次/min
表3 各组大鼠各时间点心率比较(±s)次/min
注:与正常组比较,1)P<0.01;与模型组比较,2)P<0.05,3)P<0.01。
组别正常组模型组糖脉康组低剂量组中剂量组高剂量组n 7 7 7 7 7 6第5 min 175.00±12.41 126.00±16.491)133.00±15.16 159.67±13.823)160.00±29.693)145.00±24.26第10 min 170.40±43.62 124.83±12.811)136.33±15.72 162.33±20.293)161.00±30.793)152.00±21.32第15 min 170.67±18.74 132.50±16.801)138.67±17.60 170.67±18.743)152.67±20.21 148.00±23.70第20 min 154.00±22.80 147.00±22.15 137.67±10.98 154.00±22.80 147.00±22.15 155.67±37.40第30 min 147.33±19.62 126.00±25.151)145.33±14.84 173.67±19.673)155.33±19.462)149.00±22.83
表4 各组大鼠各时间点心肌收缩幅度比较(±s)mm
表4 各组大鼠各时间点心肌收缩幅度比较(±s)mm
注:与正常组比较,1)P<0.01;与模型组比较,2)P<0.05,3)P<0.01。
组别正常组模型组糖脉康组低剂量组中剂量组高剂量组n 7 7 7 7 7 6第5 min 1.95±0.39 0.78±0.131)1.00±0.30 2.01±0.543)1.59±0.523)1.69±0.443)第10 min 2.01±0.22 0.87±0.371)1.45±0.34 1.85±0.613)1.38±0.52 1.55±0.39第15 min 2.45±0.37 0.60±0.211)1.60±0.633)2.08±0.263)1.38±0.503)1.35±0.253)第20 min 1.94±0.78 0.66±0.531)1.78±0.383)2.45±0.623)1.26±0.322)1.84±0.713)第30 min 2.67±0.89 0.67±0.591)1.47±0.342)2.16±0.603)1.77±0.673)1.77±0.523)
表5 各组大鼠各时间点冠脉流量比较(±s)mL/min
表5 各组大鼠各时间点冠脉流量比较(±s)mL/min
组别正常组模型组糖脉康组低剂量组中剂量组高剂量组n 7 7 7 7 7 6第5 min 13.01±0.39 12.86±0.32 12.95±0.22 12.87±0.27 12.99±0.36 12.79±0.21第10 min 12.91±0.20 12.79±0.34 12.98±0.52 12.69±0.33 13.09±0.52 12.78±0.16第15 min 12.84±0.34 12.90±0.30 12.79±0.42 13.02±0.31 12.83±0.35 13.34±0.39第20 min 12.83±0.12 12.88±0.18 12.74±0.34 12.76±0.23 12.60±0.33 13.03±0.30第30 min 12.85±0.28 12.83±0.56 12.88±0.36 12.90±0.36 12.52±0.13 12.74±0.29
糖尿病合并慢性心力衰竭预后差,病死率高。预防和治疗糖尿病合并慢性心力衰竭的重点在于积极控制血糖、血脂等危险因素。但是ACCORD(控制糖尿病大血管风险行动)研究和ADVANCE(2型糖尿病患者强化血糖控制与血管并发症)研究结果均表明:强化降糖和联合降脂后,糖尿病患者心血管复合终点事件发生率无显著下降。Parry[15]研究表明:HbA1c水平与心力衰竭呈“U”型关系,HbA1c过高或过低均提示心力衰竭的发病率显著升高。因此寻求一种综合改善糖脂代谢、减少心血管事件的治疗方法具有重要的临床意义。中医药治疗有多靶点、多途径、毒副作用少的优势,正如本研究结果证实丹瓜方同时具有降糖、降脂、改善心功能等作用,可有效防治糖尿病合并慢性心力衰竭。
2型糖尿病多以痰湿为患,久病痰瘀互结。痰瘀互结是糖尿病合并慢性心力衰竭的病理因素。本研究选用痰瘀同治丹瓜方,观察其对糖尿病大鼠离体心脏灌注的影响。丹瓜方中丹参、瓜蒌为君药,活血与化痰并举;赤芍、郁金、川芎、白僵蚕为臣药,助丹参、瓜蒌增强活血化痰祛邪之力;另以薤白等辛通开痹之品为佐使。全方共奏祛瘀化痰之功效。前期研究表明丹瓜方具有一定调节糖脂代谢作用,并降低心血管风险预测指标,还有抗动脉硬化和氧化应激等的作用。本研究结果提示:丹瓜方可改善糖尿病大鼠糖脂代谢,与前期研究结果一致;低剂量、中剂量丹瓜方能增加糖尿病大鼠离体心脏的搏动,不同剂量丹瓜方能改善糖尿病大鼠离体心脏收缩幅度,改善糖尿病大鼠心功能。现代药理研究也证实丹参、川芎具有改善心肌收缩力,改善心功能的作用[15-16];瓜蒌、薤白不仅可改善血糖、血脂,还可加强离体心脏收缩力,改善心功能[17-18]。
本研究证实了丹瓜方可改善糖尿病大鼠离体心脏的心肌收缩幅度、心率,对糖尿病大鼠心功能具有一定的改善作用,为临床防治糖尿病合并慢性心力衰竭提供了新的思路和实验依据。但其作用的机理和靶点尚不明确,需要在后续进一步更深入研究。
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R285.5
A
1000-338X(2015)06-0054-04
2015-10-11
福建省科技社会发展重点项目(2012Y0037);国家自然科学基金资助项目(81173179,81473550,81403329);福建省卫生厅青年项目(2013-2-58)
杨柳清(1978—),女,主治医师,主要从事中医药防治糖尿病及其并发症临床与基础研究。
衡先培(1968—),男,教授、主任医师。E-mail:hengxianpei@hotmail.com