肾阳虚大鼠股骨皮质骨差异蛋白质表达分析

王艺茹，王雯婷，李亚楠，陈宝军，张英杰，詹正烜，郑乃熙，黄露露，赖兴泉，苏友新（福建中医药大学，福建福州350122）

·实验研究·

肾阳虚大鼠股骨皮质骨差异蛋白质表达分析

王艺茹，王雯婷，李亚楠，陈宝军，张英杰，詹正烜，郑乃熙，黄露露，赖兴泉，苏友新（福建中医药大学，福建福州350122）

目的比较分析肾阳虚证模型大鼠与正常大鼠股骨皮质骨差异表达蛋白质，从骨组织功能蛋白质角度初步探讨肾阳虚证的实质。方法60只雄性WISTAR大鼠随机分为正常组和肾阳虚组，每组各30只，适应性喂养1周。肾阳虚组：臀部肌肉注射氢化可的松注射液2.5 mg／100 g，每日1次，自由饮水、饮食。正常组：自由饮食、饮水。注射造模干预15 d后继续观察3周。模型鉴定成功后分别获取肾阳虚组和正常组大鼠股骨皮质骨标本，进行总蛋白的提取制备。采用双向凝胶电泳（2-DE）技术展示2组大鼠的皮质骨蛋白质组图谱，应用PDQuest软件分析2组间差异表达蛋白点，采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）初步鉴定差异表达蛋白点。结果2组皮质骨2-DE凝胶图谱可辨别蛋白点数目为470个；与正常组比较，肾阳虚组皮质骨中存在12个已知的差异表达蛋白，其中载脂蛋白A-I、α烯醇化酶和热休克蛋白60表达上调，原肌球蛋白异构体2α-3链、I型胶原α-1链、GDP解离抑制因子β、LOC683667蛋白、白细胞酪氨酸激酶受体、线粒体ATP合酶亚基α、膜联蛋白A3、丙酮酸激酶同工酶及蛋白质二硫键异构酶A3表达下调。结论股骨皮质骨12个蛋白表达改变可能与肾阳虚证的发生有关。

蛋白质组学；肾阳虚证；大鼠；骨组织；双向电泳；质谱

“肾主骨”是中医的经典理论之一，认为“肾”与“骨”存在着密切联系，“肾强则骨强、肾虚则骨弱”，肾虚可以导致骨病，如骨软化、骨质疏松、骨质增生、骨折愈合迟缓等。肾阴虚与肾阳虚是肾虚证的基本证型，肾阳虚证是由于素体阳虚、年高肾亏、房劳过度或久病伤肾等，使肾阳亏虚，机体失于温煦所表现的一组证候，是中医最常见的证候之一。对于肾阳虚证的证候实质，虽已取得一定的共识［1－2］，但至今它的发生机理还尚未完全清楚。随着蛋白质组学技术在中医学相关研究的广泛应用，目前已经认识到中医“证”的实质与疾病个体特定的功能蛋白质组及其基因组的表达水平密切相关，疾病不同中医证型区别的实质是功能蛋白质组及其基因组的表达水平差异［3］。所以，基于中医“肾主骨”理论，本研究拟从骨组织功能蛋白质表达水平差异的角度进一步探索肾阳虚证的实质。

1 材料和方法

1.1 实验动物3月龄SPF级WISTAR大鼠60只，均为雄性，体重（210±20）g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，实验动物许可证号：SCXK（沪）2012-0002，实验动物质量合格证编号：2007000548 015。委托福建中医药大学实验动物中心代购及饲养。

1.2 主要药物与试剂氢化可的松注射液（福州海王福药制药有限公司，产品批号：1209111）；大鼠环磷酸鸟苷（cGMP）及环磷酸腺苷（cAMP）ELISA试剂盒购自上海Westang Bio-tech有限公司；固相PH梯度胶条（17 cm，pH 4-7 NL）、二硫苏糖醇、3-［（3-胆固醇氨丙基）二甲基氨基］-1-丙磺酸（CHAPS）、ReadyStrip IEF缓冲液（Bio-lyte）、矿物油（Mineral Oil）、碘乙酰胺（IAA）、分离胶缓冲液（1.5 M Tris Hcl，PH 8.8）、丙烯酰胺预混液（30%AcyBis）、四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸铵（AP）、封胶液（ReadyPrep Overlay Agarose）、甘氨酸（Glycine）、考马斯亮蓝染色液、尿素、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基磺酸钠（SDS）、蛋白定量试剂盒及Ready Prep 2-D Clean up Kit均购自美国Bio-Rad公司；硫脲、乙腈（ACN）、甘油、碳酸氢铵（Ammonium bicarbonate）、三氟乙酸（TFA）均购自美国Sigma公司；TPCK-Trypsin胰蛋白酶购自美国Promega公司；Dnase、Rnase酶购自北京TransGen公司；苯甲基磺酰氟（PMSF）购自碧云天生物技术研究所；蛋白酶抑制剂Cocktail购自上海Roche公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 主要仪器64R高速低温离心机（美国BECKMAN公司）；PROTEAN IEF Cell等电聚焦系统、PowerPacTM Universal电泳仪、PROTEANⅡxi垂直板电泳系统和灌胶模具（美国Bio-Rad公司）；Image Scanner扫描仪（美国GE公司）；ELX808酶联免疫检测仪（美国BIO-TEK）；Milli-Q超纯水仪（德国Millipore公司）；Autoflex speed质谱仪（美国BRUKER公司）。

1.4 实验动物分组及造模采用随机数字表法将大鼠分为2组，即正常组、肾阳虚组各30只。适应性喂养1周后，肾阳虚组大鼠予臀部肌肉注射氢化可的松注射液（2.5 mg／100 g），每日1次，自由饮水、饮食，连续15 d［4］。正常组大鼠给予自由饮食、饮水。

1.5 模型鉴定及标本获取注射造模后，继续观察3周，通过肉眼观察大鼠活动、反应、弓背、毛色及饮食、饮水等情况，并测量大鼠体重与体温（肛温）及检测大鼠血清cAMP、cGMP和cAMP／cGMP比值进行模型的鉴定［5］。确定模型成功后，用10%水合氯醛以300 mg／kg的剂量腹腔注射麻醉所有大鼠，在冰上操作迅速取下其股骨干，剔除软组织及骨膜部分，并用骨剪剪开，用超纯水将骨髓冲洗干净，然后用刮匙将股骨干松质骨轻轻刮除后放入5 mL的Eppendorf管中，标记后置于液氮罐中，最后转入－80℃冰柜中保存备用。

1.6 皮质骨总蛋白提取与制备取股骨皮质骨样本1 g，放在盛有液氮的研钵里研磨粉碎后转入EP管中，并加入1.5 mL样品裂解液［7 mol／L尿素、2 mol／L硫脲、4%（W／V）CHAPS、1%（V／V）两性电解质载体、50 mmol／L DTT、20 mmol／L Tris、20 mmol／L PMSF］，于4℃冰箱中裂解提取蛋白质4 h；然后置于低温高速离心机以14 000 rpm离心30 min，吸取上清液；每1 mL裂解液加入2μL Dnase和2 μL Rnase，冰上放置15min；用超声清洗仪超声致液体不黏稠为止，然后4℃、14 000 rpm离心30 min，吸取上清液；2-D clean-up试剂盒按操作说明书提纯浓缩蛋白；Bradford法［6］测定蛋白浓度并计算上样蛋白体积。

1.7 双向凝胶电泳根据美国Bio-Rad公司的2-DE操作指南和相关文献［7］进行操作。第一向为IEF电泳，本实验选用长17 cm，pH为4～7的IPG预制胶条，胶条泡胀电压为50 V 12 h，电泳参数设定：250 V 1 h、1 000 V 1 h、4 000 V 3 h、8 000 V 11 h、500 V维持。聚焦完成后进行两次胶条的平衡及润洗，然后进行第二相SDS-PAGE电泳，起初恒压100 V 40 min后，换用恒压300 V 4.5 h，待示踪溴酚蓝跑至距凝胶底部约1 cm时停止电泳。

1.8 凝胶蛋白点染色及差异表达蛋白点靶定电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃板，取出凝胶，用考马斯亮蓝染色液染色过夜，然后用配好的脱色液进行多次脱色，直至胶的背景清晰且蛋白点明显，再用Image Scanner扫描仪获取2-DE凝胶图片；应用PDQuest 8.0分析软件进行凝胶图谱蛋白点检测，并以蛋白点相对标准化体积变化达1.5倍以上为标准进行差异表达蛋白的靶定。

1.9 质谱分析样品制备将检定的差异表达蛋白点从凝胶上手工切下，切成1 mm3大小置于1.5 mL EP管中；行脱色、脱水等处理后进行胰蛋白酶酶解；酶解后取上清液移至另一新的0.5 mL EP管中，剩下的胶块加入100μL萃取液（60%ACN，含0.1% TFA），超声15 min，离心，合并上清液，冻干，待做质谱分析。

1.10 质谱分析与数据库搜索完全冻干的样品用0.1%TFA重溶，进行质谱分析。采用板上混合点样的方法进行质谱鉴定，然后应用flex analysis软件对获得的质谱数据进行分析，分析后的每一个样品的一级和二级质谱数据再整合成一个文件，使用MASCOT（V3.2，Matrix Science，London，U.K）搜库软件进行检索，MASCOT蛋白质显著性检验，P＜0.05被认为是可靠的鉴定结果。

1.11 统计学处理使用SPSS17.0软件对2组大鼠测量的数据进行统计学分析，计量数据属正态分布均以x±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.01为有非常显著性差异。

2 结果

2.1 2组大鼠一般状态及环核苷酸系统比较造模后，肾阳虚组大鼠出现活动减少、反应迟钝、体毛枯疏并失去光泽、爪甲与耳朵颜色变淡、弓背蜷缩、喜扎堆等畏寒怕冷表现，采食量与饮水量减少，体温及体重显著下降（P＜0.01），见表1、表2。cAMP含量下降，cGMP含量升高，cAMP／cGMP比值降低，均有非常显著性差异（P＜0.01），见表3。

表1 2组大鼠体重比较（±s）g

表1 2组大鼠体重比较（±s）g

注：与正常组比较，1）P＜0.01。

造模后第2 1天3 7 1 . 9 0 ± 1 8 . 5 6 2 9 0 . 6 3 ± 1 4 . 5 91）组别正常组肾阳虚组n 3 0 2 7造模前2 5 4 . 1 0 ± 1 4 . 6 9 2 5 3 . 9 3 ± 1 5 . 5 0造模第1 5天3 0 5 . 6 7 ± 1 8 . 3 5 2 6 7 . 4 8 ± 1 5 . 5 31）

表2 2组大鼠体温比较（±s）℃

表2 2组大鼠体温比较（±s）℃

注：与正常组比较，1）P＜0.01。

造模后第21天38.13±0.34 37.33±0.311）组别正常组肾阳虚组n 30 27造模前38.12±0.30 38.11±0.39造模第15天38.13±0.33 37.17±0.371）

表3 造模后第21天2组大鼠cAMP、cGMP含量比较（±s）

表3 造模后第21天2组大鼠cAMP、cGMP含量比较（±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.01。

cAMP／cGMP 4.65±1.03 0.89±0.261）组别正常组肾阳虚组n 5 5 cAMP／（pmol·mL-1）36.20±2.98 23.44±7.231）cGMP／（pmol·mL-1）8.00±1.33 26.18±1.621）

2.2 皮质骨总蛋白双向电泳图谱及差异表达蛋白点标识结果见图1，经过蛋白点检测，2组凝胶图谱可辨识的蛋白点数目均为470个。通过软件对蛋白点的匹配分析并结合人工对比综合判断，检测到12个明显差异表达蛋白点。以正常组为参考，其中点1207、4302、3105、3705、7006、8105、8305、7401、6800为下调表达，6104、4108、6706为上调表达。

2.3 差异表达蛋白的MAIDI-TOF-MS质谱鉴定将明显差异表达的12个蛋白质点从凝胶上手工切下，经胰蛋白酶酶解消化后进行MALDI-TOF-MS质谱分析。获得的肽质量指纹图谱信号强且基线较平稳，噪音低，适于进行数据库检索。根据12个差异表达蛋白点肽段的MS和MS／MS质谱图信息，使用MASCOT搜库软件进行蛋白质点鉴定，表4为质谱鉴定的蛋白点相关信息，包括蛋白质的编号、蛋白质种类、分子量、等电点等。

图1 股骨皮质骨总蛋白双向电泳图谱及差异蛋白点标识

表4 差异表达蛋白的MALDI-TOF-TOF／MS鉴定结果

2.4 差异表达蛋白相关功能的生物信息学检索将质谱鉴定确立的12种已知差异表达蛋白名称输入UniProt及NCBI蛋白质数据库中进行蛋白相关功能的生物信息学检索，结果见表5。

2.5 肾阳虚大鼠皮质骨差异表达蛋白的种类根据差异表达蛋白点标识与质谱鉴定结果得出：肾阳虚大鼠股骨干皮质骨中存在上调表达的蛋白3个，分别为载脂蛋白A-I、α烯醇化酶和热休克蛋白60；下调表达的蛋白9个，分别为原肌球蛋白异构体2α-3链、I型胶原α-1链、GDP解离抑制因子β、LOC683667蛋白、白细胞酪氨酸激酶受体、线粒体ATP合酶亚基α、膜联蛋白A3、丙酮酸激酶同工酶及蛋白质二硫键异构酶A3。

3 讨论

蛋白质组的相关研究是后基因组研究的重要内容［8］，它从整体上对细胞、组织或者有机体整体蛋白质组进行研究与分析，从而在更深层面阐明生命的现象与本质。蛋白质组学技术具有高通量、横向平行及动态性等优势，可以研究健康或病理状态下相同个体生命活动规律所表现的总体蛋白质的差异，借以阐明疾病机理、解释药物作用机制、鉴定疾病分子标志物、揭示中医证候实质等，且方法也不断成熟与稳定，是当前生物医学领域的重要研究平台［9－10］。肾阳虚证的证候表现一定有其物质基础［11］，这个物质基础可能就是一组差异表达的蛋白质，因为蛋白质是生命征象（包括各种症状、体征的疾病症候）的体现者，是执行生命功能的载体［12－13］。“肾主骨”是中医“脏象”学说的重要内容之一，认为骨的盛衰健壮与肾的功能密切相关，肾虚可以导致骨病，也就是说骨组织的代谢变化与生化改变与“肾”功能状态存在着对应关系，那么骨组织的功能蛋白质组表达水平与肾阳虚证之间也必然存在着关联性。基于以上的认识，本研究借助于蛋白质组学的技术与方法，基于中医“肾主骨”的理论，从大鼠股骨皮质骨差异表达蛋白质表达角度探讨肾阳虚证的部分实质。

表5 蛋白质相关功能的生物信息学检索结果

本实验通过肌注氢化可的松建立肾阳虚证候模型大鼠，并采用大鼠相关状态的观察及血清环核苷酸系统的检测对模型进行鉴定。研究结果表明：肾阳虚证模型大鼠的症状、体征和血清cAMP、cGMP含量检测及cAMP／cGMP比值结果均符合肾阳虚证模型的鉴定要求［14］，提示肾阳虚模型造模是成功的。

通过对大鼠股骨皮质骨蛋白质组图谱、差异表达蛋白点比较分析以及质谱鉴定的结果分析表明：相对于正常组，肾阳虚组股骨皮质骨载脂蛋白AI、α烯醇化酶和热休克蛋白60等3个蛋白表达上调，原肌球蛋白异构体2α-3链、I型胶原α-1链、GDP解离抑制因子β、LOC683667蛋白、白细胞酪氨酸激酶受体、线粒体ATP合酶亚基α、膜联蛋白A3、丙酮酸激酶同工酶及蛋白质二硫键异构酶A3等9个蛋白表达下调。这些差异的蛋白质按功能可以大致分为4类：①催化类蛋白4个：如丙酮酸激酶同工酶、ATP合酶亚基α、蛋白质二硫键异构酶A3、α烯醇化酶；②结构及支架类蛋白质2个：I型胶原α-1链、原肌球蛋白异构体2α-3链；③转运类蛋白质2个：LOC683667、载脂蛋白A-I；④调节类蛋白质4个：膜联蛋白A3、GDP解离抑制因子β、白细胞酪氨酸激酶受体、线粒体热休克蛋白60。以上研究结果提示：上述12种蛋白的表达差异与肾阳虚证的发生存在着密切联系，这些蛋白质表达异常可能通过股骨干皮质骨结构构成、化学反应、物质转运、新陈代谢和细胞凋亡等方面的改变而影响肾阳虚证的发生及出现各种症候群。

本研究仅初步比较并确认正常大鼠与肾阳虚证候模型大鼠中股骨皮质骨的差异表达蛋白质，对它们的鉴定与验证有待于今后进一步的研究。

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R274

A

1000-338X（2015）06-0050-04

2015-10-05

国家自然科学基金资助项目（81273888）

王艺茹（1986—），女，硕士研究生。

苏友新（1969—），男，医学博士，教授，博士生导师。E-mail：suyouxin777@hotmail.com