核桃炭疽病生防菌yb33的鉴定及其次生代谢物特性分析

韩长志，霍 超

（西南林业大学a.林学院；b.云南省森林灾害预警与控制重点实验室，云南 昆明 650224）

核桃炭疽病生防菌yb33的鉴定及其次生代谢物特性分析

韩长志a,b，霍 超a,b

（西南林业大学a.林学院；b.云南省森林灾害预警与控制重点实验室，云南 昆明 650224）

为了较好地利用生防菌防治核桃炭疽病，采用土壤稀释平板法和对峙培养法，从核桃根际土壤中分离筛选获得了yb23、yb31、yb33、yb34菌株（其对核桃炭疽病菌的抑菌活性均在60%以上），然后对其中生防效果较好的菌株yb33进行了形态学与分子生物学鉴定，并对该菌次生代谢产物的性质进行了分析。鉴定结果表明：菌株yb33为芽孢杆菌属细菌，其与Bacillus axarquiensis的亲缘关系最近。分析结果表明：不同浓度yb33无菌滤液的抑菌效果间具有明显的差别，其在65 ℃及其以下温度条件下的热稳定性较好。

核桃炭疽病菌；yb33；枯草芽孢杆菌；生物防治

云南省的核桃生产在全国核桃生产中占有非常重要的地位，其核桃栽培面积和产量约占全国的1/3[1]。种植核桃历史较为悠久的大理州漾濞彝族自治县作为云南省五个“全国经济林核桃之乡”之一，其核桃产量、品质均居云南省首位[1]。然而，由胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides引起的核桃炭疽病是近几年核桃树遭到的重要真菌病害，严重地危害着当地核桃产业健康、有序、快速的发展。据近3年对漾濞核桃产区核桃炭疽病的病害调查结果，病害严重的年份该病发生率高达90%以上，这给当地核桃生产造成了较为严重的经济损失。

核桃生产中对于核桃炭疽病的防治主要依赖于化学药剂，而病原菌的抗药性逐年显现[2-4]，特别是该病害发展迅速，急需开发适用于生产的优良药剂[5]。目前，学术界对于化学药剂的替代品生防菌的研究报道逐年增加，对生防菌的筛选与研究多集中于农作物[6]、蔬菜[7]等领域，而对于木本油料作物生防菌的研究报道却较少。前人在对核桃炭疽病生防菌的筛选研究中发现，短芽孢杆菌Bacillus brevisPF-2对C. gloeosporioides的抑菌率最高（88.47%），还有3株均属于芽孢杆菌属的细菌对核桃炭疽病菌也有83%以上的抑菌率[8]。尽管如此，由于生防菌具有地域局限性特点[9]，对于能用以防治云南省核桃炭疽病的生防菌的研究却尚未见诸报道。为此，以来自于当地的核桃炭疽病菌作为指示菌，从核桃种植地根际土样中分离出拮抗效果较好的生防细菌，并对其次生代谢物的特性进行了研究，以期为当地核桃炭疽病的生物防治提供菌株资源和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

土壤样本：选择发病程度不同的核桃根际周围的土壤，铲去10 cm的表土层，取10～15 cm处的土样50～200 g，共取土壤样本8份。

供试菌株：西南林业大学植物病理学实验室保存的核桃炭疽病菌菌株yb-1。

培养基：葡萄糖琼脂培养基（PDA）用于核桃炭疽病菌的培养，肉汤蛋白胨固体培养基（NA）用于土壤细菌的分离培养，马铃薯葡萄糖＋0.5%牛肉浸膏培养基用于分离细菌发酵液的培养。

1.2 土壤生防菌的分离与纯化

采用土壤稀释平板法进行分离[10]，置于28 ℃的恒温培养箱中培养24 h后，平板划线进行纯化，每处理重复4次，获得菌株，并进行编号，然后置于4 ℃的冰箱中保存以备用。将分离得到的菌株以“yb”为开头字符进行编号，“yb”字符后的前一个编码表示土壤样本的编号，后一个编码表示菌株的编号，如yb11，即从1号土样中分离到的1号菌株。将分离到的菌株经纯化后转入试管斜面保存以备用。

1.3 生防菌株的筛选

采用平板对峙培养法[11]进行筛选，根据处理病原菌生长直径和对照病原菌生长直径的差异来计算抑菌率，计算公式为：

抑菌率(%)＝(对照组菌落直径－处理组菌落直径)/对照组菌株菌落直径×100。

先对所获得的全部菌株进行初次筛选，病原菌和土壤分离菌的比例为1∶4，记录抑菌圈的大小，筛选出效果较好的菌株；然后对初次筛选出的效果较好的菌株进行第二次筛选即复筛，病原菌和土壤分离菌的比例为1∶2，记录抑菌圈的大小，筛选出对病原菌作用效果明显且稳定的生防菌株，以备后续研究之用。

1.4 对yb33的形态学及分子生物学鉴定

将在NA平板上培养24 h的菌株yb33装片，在生物显微镜尼康E800下观察菌株的微观形态，并测定其大小，根据革兰氏染色呈现出的颜色和形态特征，依据《常见细菌系统鉴定手册》进行鉴定[12-13]。

挑取以NA培养基培养的菌落，将其置于肉汤蛋白胨培养液中过夜培养，过滤，提取菌 株 yb33的 DNA。PCR 反 应 体 系 为 50 µL，其 中，2×MasterMix 25 µL，DNA 5 µL， 上 游引物（27f）、下游引物（1492r）均为 5 µL，ddH2O 为 10 µL。 通 用 引 物 分 别 为 27f（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’） 和 1492r（5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’）；反应条件为94 ℃预变性2 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 2 min，72 ℃延伸5 min，35个循环。

利用琼脂糖凝胶电泳技术检测PCR扩增产物，选择具有特异性条带的样品送至昆明硕阳科技公司测序。将所测序列与NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）数据库中已报道的序列进行Blastn比对，确定其分类地位。同时，利用ClustalX[14]对已经报道的枯草芽孢杆菌及yb33进行多重比对分析，再利用MEGA 5.2.2软件[15]构建系统进化树，即采用邻近法构建系统发育树，采用p-distance模型计算各分支之间的距离，采用自举法，重复1 000次，对系统的可信度进行检测。

1.5 yb33次生代谢产物的提取

将在NA上培养24 h的yb33接种于马铃薯葡萄糖＋0.5%牛肉浸膏培养液中，于转速为200 r/min、温度为30 ℃的摇床上振荡培养48 h，取适量发酵液，室温下以转速为4 800 r/min离心20 min，获得上清液，之后用孔径为0.2 µm的细菌过滤器过滤，即得无菌滤液，将无菌滤液置于4 ℃的冰箱中保存以备用[16]。

1.6 yb33次生代谢产物抑菌活性及热稳定性的测定

采用平板稀释法，将yb33无菌滤液分别以1/10、1/50、1/100倍的比例与40 ℃左右的PDA培养基均匀混合，以未加无菌滤液的PDA作为对照。各平板中央接种直径为6 mm的核桃炭疽菌菌丝块，28 ℃下培养，每个处理4个重复。待对照菌落长满培养皿时，用十字交叉法测量菌落直径，并计算抑菌率。

在30、45、65、85、100、121 ℃的条件下对yb33无菌滤液分别处理10、30、60 min，与40 ℃左右的PDA培养基混匀，制成含有浓度为1/10的无菌滤液的PDA平板，以无菌水和未经热处理的无菌滤液作为对照，其处理方法同上。

2 结果与分析

2.1 土壤生防菌的分离和筛选

经初筛总共获得33个菌株，其中抑菌率超过60%的菌株有7个，其编号分别为yb21、yb42、yb23、yb31、yb33、yb34、yb41；将上述初筛出的菌株进行复筛，结果发现，菌株yb33、yb31的抑菌效果最好，可达80%以上，其与病原菌相接处有很明显的拮抗菌带，抑菌效果明显且稳定。土壤拮抗菌株初筛与复筛的抑菌效果详见表1与图1。

2.2 yb33的鉴定及遗传关系分析

对yb33的形态特征进行观察，结果如图2A～C所示。图2A～C显示，菌落表面粗糙不透明，呈污浊的白色或微黄色，该菌落呈杆状，有芽孢，单个细胞的大小为（0.7～0.8）×（2.0～3.0）mm，经革兰氏染色呈阳性，着色均匀。

表1 土壤拮抗菌株初筛与复筛的抑菌效果Table 1 Antifungal effects of antagonistic strains obtained by preliminary screening and second screening

图1 yb33和yb31的抑菌效果Fig. 1 Antifungal effects of yb33 and yb31

图2 yb33形态特征的鉴定结果Fig. 2 Identification result of yb33 based on morphological characteristics

依据《常见细菌系统鉴定手册》[13]对该菌株进行鉴定，同时对其16S RNA序列进行克隆、测序等分子生物学鉴定，通过NCBI比对分析，明确了yb33与枯草芽孢杆菌属包括Bacillus mojavensisstrain SWFU16、Bacillus tequilensisstrain YJ-S4、Bacillus mojavensisstrain 263XG8等菌种在内的众多菌株相一致，此外，结合已经报道的芽孢杆菌序列[17]进行遗传关系分析，结果（如图3）表明，诸多已经报道的枯草芽孢杆菌属可以分为六大类，其中，yb33与Bacillus axarquiensisstrain 261MG2的亲缘关系最近，属于A类。

图3 yb33与芽孢杆菌属其他菌之间的遗传关系分析Fig. 3 Genetic relationships analysis of yb33 strain and other strains in Bacillus

2.3 yb33次生代谢产物的抑菌作用

与yb33菌株具有抑菌作用相似，其无菌滤液对核桃炭疽病菌也有较好的抑制作用，能减慢病原菌菌丝的生长，浓度为0.1时，抑菌效果高达92.86%，然而，随着浓度的减小，抑菌效果明显减弱，浓度为0.02时，抑菌率为29.76%，浓度减到0.01时，抑菌率只有14.29%，上述结果表明，不同浓度无菌滤液的抑菌效果之间具有明显差别，推测无菌滤液中含有抑制病原菌生长的拮抗物质（如图4所示）。

图4 不同浓度无菌滤液对病原菌生长的影响Fig. 4 Effect of different concentrations of sterile filtrates on growth of pathogens

2.4 yb33次生代谢产物的热稳定性

yb33无菌滤液的抑菌效果在65 ℃及其以下的热稳定性较好，处理10～60 min后，其抑菌效果变化波动比较小；而65～100 ℃处理下，其抑菌效果变化波动非常大，特别是在121 ℃处理下，其抑菌效果则出现较大的变化（图5）。同时发现，相同温度不同时间处理也会对抑菌效果产生影响，即随着处理时间的增加，其无菌滤液的抑菌效果则减弱（图5）。上述结果表明，yb33无菌滤液在室温条件以及较为极端的自然温度条件下具有较好的热稳定性，具有进一步作为生防菌资源的潜力。

图5 无菌滤液经不同温度不同时间处理后的抑菌效果Fig. 5 Antifungal effects of sterile filtrates after treated for different time at different temperatures

3 结论与讨论

近年来，国内外学者对于生防菌筛选的研究开展了大量工作，尽管如此，对于木本油料作物的重要病害的生防菌的研究报道却较为少见[18]，同时，鉴于生防菌具有较强的地域性特点，本研究采用对峙培养法对分离于云南省漾濞县核桃根际周围土壤的拮抗核桃炭疽病菌的生防菌进行了筛选，结果显示，枯草芽胞杆菌属细菌yb33对核桃炭疽病菌具有较好的抑菌效果，其无菌滤液具有较好的抑菌效果和热稳定性，作为田间生防菌其有进一步研究的潜力。

目前研究报道的生防菌主要包括芽孢杆菌、假单胞杆菌、放射性土壤农杆菌和巴氏杆菌等种细菌，尤以枯草芽胞杆菌属细菌居多，如XG-1对西瓜枯萎病菌菌丝生长具有较强的抑制作用[19]，Henu11对禾谷丝核菌具有较好的抑制作用[6]，N-193对辣椒炭疽病菌具有明显的拮抗作用[20]。此外，枯草芽孢杆菌OBS-2对尖镰孢香草兰专化型和腐皮镰孢菌能产生明显的拮抗带，且该菌株较外地菌株（1.936菌株）的生防效果要好[9]，因此，筛选本地枯草芽孢杆菌更具有实际应用价值。

此外，对于云南省漾濞县核桃的研究还有关于引种核桃品种嫁接成活率及苗期生长性状[21]方面的报道，而对于其他省份不同核桃品种的遗传多样性[22]也有一些研究报道，然而，尚缺乏对于核桃上诸多病害的系统研究以及利用生防菌开展某种病害防治的研究报道，这将成为未来核桃研究的重要方向。

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Identification of bio-control strain yb33 against walnut anthracnose and analysis of its secondary metabolite characteristics

HAN Chang-zhia,b, HUO Chaoa,b
(a. Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control of Yunnan Province; b. College of Forestry, Southwest Forestry University, Kunming 650224, Yunnan, China)

In order to better utilizing bio-control strains against walnut anthracnose, the strains of yb23, yb31, yb33 and yb34 were isolated by using soil dilution plate method and dual culture method, which had over 60% of the antifungal activity. The yb33 strain with higher antifungal activity was identified from the aspects of morphology and molecular biology, and characteristics of its secondary metabolites were analyzed. The results showed that, yb33 strain belongedBacillus subtilis, and had close genetic relationships withB. axarquiensis.Antifungal effects had significant differences between the yb33 sterile filtrates at different concentrations, and the sterile filtrates had good thermal stability at below 65 ℃.

walnut anthracnose; yb33;Bacillus axarquiensis; bio-control

10.14067/j.cnki.1003-8981.2015.03.011 http: //qks.csuft.edu.cn

2014-10-04

云南省优势特色重点学科生物学一级学科建设项目（50097505）；云南省高校林下生物资源保护及利用科技创新团队项目（2014015）；云南省教育厅科学研究基金项目（2014Y330）。

韩长志，讲师，博士。E-mail：hanchangzhi2010@163.com

韩长志,霍 超.核桃炭疽病生防菌yb33的鉴定及其次生代谢物特性分析[J].经济林研究,2015,33(3):63－67, 74.

S664.1

A

1003—8981(2015)03—0063—05

[本文编校：伍敏涛]