响应面试验优化超临界CO2酯交换法制备低能SLS型结构脂质工艺

张家明，许多现，李相昕，齐晓芬，张 旭，于殿宇*

（东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

响应面试验优化超临界CO2酯交换法制备低能SLS型结构脂质工艺

张家明，许多现，李相昕，齐晓芬，张 旭，于殿宇*

（东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

在超临界CO2状态下，采用脂肪酶RMIM催化乙酸乙酯与一级大豆油反应制备SLS型结构脂质，分别应用单因素试验和响应面试验考察酶用量、反应压力、温度和时间对乙酸乙酯转化率的影响。结果表明，最佳工艺条件为酶用量2.9%、反应时间13.1 h、反应压力9.4 MPa、反应温度49.0 ℃，此条件下乙酸乙酯的转化率可达到36.1%，经纯化后获得纯度为90.3%、热值为22.35 kJ/g的SLS型结构脂质，与普通大豆油相比，热值降低了42%。

超临界CO2；脂肪酶；结构脂质；乙酸乙酯转化率

油脂能赋予食品独特的口感与风味，是食品的重要组成部分，但高脂肪的摄入会引起肥胖、某些癌症和心血管疾病等[1-3]。目前，肥胖病人及相关疾病在逐年增加，因而，开发口感、风味等性质与天然油脂相同，而发热量较低的低能油脂已成为人们研究的热点[4-6]。

酯交换生产低能油脂主要有化学法和酶法两种[7]。传统的酯交换生产低能油脂产品主要是采用化学催化法合成，但此法存在着反应温度高、化学污染严重、产物色泽差等缺点；目前，国内外多以酶催化法合成，该法在有机溶剂和无溶剂中反应都取得了较好进展，但在超临界二氧化碳（supercritical CO2，SC-CO2）状态酶法催化合成低能油脂鲜有相关报道。SC-CO2状态下酶反应，是近年来生物工程新开拓的领域[8-9]。当CO2达到临界温度（31.1 ℃）和压力（7.28 MPa）以上时，物理性质介于流体和气体之间，CO2显示出较大的溶解能力和较高传递特性，从而可大大降低酶反应过程的传质阻力，提高酶反应速率[10]；另外，SC-CO2无毒、不可燃、化学惰性佳、易与反应物底物分离[11-13]。这些优点和特点使其在食品工业上的应用具有广阔的发展前景。由于乙酸酸性较强，在反应体系中可能会影响脂肪酶的活性，体系中乙酸的含量过高也会产生大量的羧基基团，从脂肪酶表面夺走部分必需水，而且可以从油水界面进入到周围的水层中，导致底物抑制效应的发生[14]。因此，本实验以乙酸乙酯和一级大豆油为原料，对超临界状态下利用1,3特异性脂肪酶催化合成低能SLS型结构脂质进行研究，探讨反应压力、反应温度、反应时间和酶用量对转化率的影响，进而最大限度地合成Sn-1、Sn-3为短链、Sn-2为长链的长短链脂肪酸甘油三酯（SLS型结构脂质）。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆一级油 九三粮油工业集团有限公司；无水乙醇、冰醋酸（分析纯） 黑龙江双城市鑫田化学试剂制造有限公司；固定化脂肪酶RMIM（酶活力275 IUN/G）丹麦诺维信公司；CO2（纯度＞99.99%） 北京京高气体有限公司。

1.2 仪器与设备

恒温水浴锅 余姚市东方电工仪器厂；高压反应釜威海新元化工机械有限公司；ZK-GT2A型分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；XW-80A 微型旋涡混合仪 上海沪西分析仪器厂；RE-51A 型旋转蒸发器上海博通经贸有限公司；DF-101 集热式恒温加热磁力搅拌器 上海卓康生物科技有限公司；分子蒸馏仪 德国UIC gmbh公司；GC-14B气相色谱仪 日本岛津公司；ZDHW-5000微机全自动量热仪 鹤壁华源仪器。

1.3 方法

1.3.1 乙酸乙酯的制备

在50 mL圆底烧瓶中加入9.5 mL（0.2 mol）无水乙醇和6 mL（0.1 mol）冰醋酸，再小心加入2.5 mL浓硫酸，混匀后加入沸石，再装上冷凝管。小心加热反应瓶，缓慢回流0.5 h，冷却反应物，将回流装置改成蒸馏装置，接受瓶用冷水冷却，蒸出生成的乙酸乙酯，直到馏出液约为反应物总体积的1/2为止。在馏出液中慢慢加入饱和碳酸钠振荡至不再有CO2气体产生为止。将混合液转入分液漏斗，分去下层水溶液，有机层用5 mL饱和氯化钠洗涤，再用5 mL氯化钙洗涤，最后用水洗涤一次，分去下层液体。有机层倒入干燥三角烧瓶中，用无水硫酸镁干燥。将干燥后的有机物进行蒸馏，收集72～78 ℃馏分乙酸乙酯，称量收集到的乙酸乙酯的质量。

1.3.2 酶促酯化

在高压反应釜中按2∶1的物质的量比加入乙酸乙酯与一级大豆油和2%的水分，同时加入转子和一定量的脂肪酶，将反应釜密封后充入少量CO2以置换出反应釜中的空气，同时试漏，确定反应釜密封情况良好后，在加压泵的作用下充入CO2使反应釜内达到一定压力，然后将反应釜置于水浴锅中，调节磁力搅拌器的转速至120 r/min，在一定温度条件下反应一定时间。

1.3.3 乙酸乙酯含量的检测

采用薄层色谱（thin layer chromatography，TLC）法进行乙酸乙酯的定量和定性分析[15-17]。

1.3.4 酯交换率计算

式中：C0为反应初始体系中乙酸乙酯的单位含量/（g/g）；C1为反应完毕后体系乙酸乙酯的单位含量/（g/g）。

1.3.5 产品的纯化

反应完毕后，取出转子，将反应釜内的物质高速离心除去固定化脂肪酶，取上述物质装入分子蒸馏的物料瓶中，在冷阱中装入液氮后，打开真空泵，对反应产物脱气，待脱气完毕后，设定所需的蒸馏温度100 ℃、真空度0.5～0.8 Pa，固定冷凝面温度5 ℃，设定蒸馏刮膜转速为150 r/min，调节进料阀保持进料流量约为1.5 mL/min（1 滴/3 s），进而进行分子蒸馏纯化（在蒸馏过程中视液氮挥发程度及时补充冷阱中的液氮），对所得馏出物（主要成分为脂肪酸乙酯、乙酸乙酯、单甘酯、甘二酯等）和馏余物（重相主要成分为甘油三酯）分别进行收集，将得到的馏余物利用寿佳菲等[18]在中长链脂肪酸甘油三酯的制备与分离纯化研究中的分离纯化方法，获得提纯后的产物并利用气相色谱[19]对其进行定性分析，从而确定获得产物中以SLS型结构脂质为主。再次利用寿佳菲等[18]研究，对所得产物进行进一步的纯度检测，按式（2）计算SLS型结构脂质的纯度：

1.3.6 低能SLS型结构脂质制备工艺优化

在单因素试验的基础上，对反应压力、反应温度、反应时间、酶用量采用Box-Behnken试验进行优化，以确定制备低能SLS型结构脂质工艺条件，响应面试验因素水平见表1。

表1 响应面试验因素与水平Table1 Factors and levels used in Box-Behnken design

1.3.7 产品指标的测定

碘值的测定：参照GB/T 5532—2008《动植物油脂碘值的测定》；酸值的测定：参照GB/T 5530—2005《动植物油脂酸值和酸度测定》；过氧化值的测定：参照GB/T 5538—2005《动植物油脂过氧化值的测定》；皂化值的测定：参照GB/T 5534—2008《动植物油脂皂化值的测定》；大豆油色泽的测定：参照GB/T 22460—2008《动植物油脂罗维朋色泽测定》；油脂热值的测定：参照粟智等[20]的研究。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 酶用量对乙酸乙酯转化率的影响

酶用量分别取 1%、2%、3%、4%、5% 时，固定反应压力9 MPa、反应温度50 ℃、反应时间11 h，酶用量对乙酸乙酯转化率的影响见图1。

图1 酶用量对乙酸乙酯转化率的影响Fig.1 Effect of RMIM lipase concentration on ethyl acetate conversion rate

在超临界高压条件下，脂肪酶活力基本不受影响[21]。由图1可知，随着酶用量的增加，乙酸乙酯的转化率也随之提高，但当酶用量达到3%以上时，乙酸乙酯转化率的增加趋势不明显，这可能是随着酶用量的增加，酶分子与底物接触的机会增加，反应速率加快，酯化反应程度提高，但酶用量达到3%后由于酶用量过高时，水解反应所需的水分子不足，不能及时为水解提供所需的水分，导致反应不能及时进行。同时脂肪酶价格较高，出于成本考虑，酶用量选择3%最为适宜。

2.1.2 反应时间对乙酸乙酯转化率的影响

反应时间分别取 7、9、11、13、15 h 时，固定酶用量3%、反应压力9 MPa、反应温度50 ℃，反应时间对乙酸乙酯转化率的影响见图2。

图2 反应时间对乙酸乙酯转化率的影响Fig.2 Effect of reaction time on ethyl acetate conversion rate

由图2可知，开始时，随着反应时间的延长，乙酸乙酯的转化率不断提高，但反应时间达到13 h后上升效果不再显著，这可能是因为随着反应时间延长，底物质量浓度减少和酶活力下降，使反应速率逐渐减慢，转化率的增长趋于平缓。综合考虑反应时间以13 h为宜。

2.1.3 反应压力对乙酸乙酯转化率的影响

反应压力分别取7、8、9、10、11 MPa时，固定酶用量3%、反应温度50 ℃、反应时间13 h，反应压力对乙酸乙酯转化率的影响见图3。

图3 反应压力对乙酸乙酯转化率的影响Fig.3 Effect of reaction pressure on ethyl acetate conversion rate

压力对脂肪酶本身体系影响不大，主要是它影响了SC-CO2的性质，从而影响反应速率及转化率[22]。由图3可知，随着反应压力的增加，反应速率加快，从而可相应缩短反应时间，当压力达到10 MPa以上时，乙酸乙酯转化率的提高不再显著，因此反应压力10 MPa较为适宜。

2.1.4 反应温度对乙酸乙酯转化率的影响

反应温度分别取30、40、50、60、70 ℃时，固定酶用量3%、反应压力10 MPa、反应时间13 h，反应温度对乙酸乙酯转化率的影响见图4。

图4 反应温度对乙酸乙酯转化率的影响Fig.4 Effect of reaction temperature on ethyl acetate conversion rate

由图4可知，当温度从30 ℃升至50 ℃时，乙酸乙酯的转化率随之逐渐上升，这说明随着温度的升高，脂肪酶的催化活性部位逐渐暴露，发挥出较强的活性。当温度达到50 ℃时，脂肪酶催化活性达到极值，之后酯化程度开始下降，这有可能是较高温度致使酶部分失活而引起的。可见，脂肪酶RMIM在催化酯化反应的最佳温度在50 ℃左右。

2.2 响应面试验结果

在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken设计[23-24]，以酶用量（A）、反应时间（B）、反应压力（C）、反应温度（D）为自变量，以乙酸乙酯转化率为响应值设计四因素三水平响应面试验。试验设计方案及结果见表2。

表2 响应面试验设计方案及结果Table2 Experimental design and results for response surface analysis

根据表2中乙酸乙酯转化率试验数据，应用Design-Expert 7.5.0软件对试验结果进行方差分析，所得主要分析结果见表3。

通过对试验所得数据进行回归拟合，得到乙酸乙酯转化率（Y）对自变量酶用量（A）、反应时间（B）、反应压力（C）和反应温度（D）的回归方程为：

Y=35.15－0.55A＋0.98B＋3.82C＋0.11D－0.55AB－0.59AC＋0.12AD－1.68BC＋1.55BD－2.73CD－3.46A2－3.22B2－5.26C2－4.48D2

表3 回归变量方差分析结果Table3 Analysis of variance of regression model

从表3可以看出，失拟项P值为0.422 8＞0.05，表明失拟不显著。模型的P值是0.000 1，可知该模型的预测值与实测值比较相符的；方程的相关系数R2为0.924 5，调整后的R2为0.863 4，表明模型可以解释86.34%的超临界条件乙酸乙酯转化率水平的变化，进一步说明了回归方程的拟合程度较好。

根据上述回归方程绘出响应面分析图，以确认酶用量、反应时间、反应压力、反应温度4 个因素对转化率的影响，响应面见图5。

图5 不同因素对乙酸乙酯转化率影响的响应面图Fig.5 Response surface plots for the interactive effects of different factors on ethyl acetate conversion rate response

三维响应面图可用来直观地表达各因素之间的相互作用[25]。任取两个因素为自变量，固定其他因素使其编码值为零水平，可以通过回归方程计算出相应的响应值，绘出两个因素与乙酸乙酯转化率之间关系的响应面，可以更直观地观察两因素的相互影响情况。最大的椭圆，即最外围的椭圆代表在该圆上取值时，乙酸乙酯转化率最低，而最小的椭圆则表示在其上面取值时，乙酸乙酯转化率最高，最小与最大之间的等高线代表乙酸乙酯转化率逐渐变化。

对回归方程求一阶偏导数，当响应值乙酸乙酯转化率取最大值时，所得4 个因素最佳水平真实值分别为酶用量2.88%、反应时间13.07 h、反应压力9.39 MPa、反应温度48.99 ℃，对应乙酸乙酯转化率的最大值为35.94%。对4 个因素值进行整理得到相应条件为酶用量2.9%、反应时间13.1 h、反应压力9.4 MPa、反应温度49.0 ℃。为了检验运用响应面方法分析所得结果的可靠性，按照上述整理值进行实验，得到的乙酸乙酯转化率为36.1%。预测值与实测值之间具有良好的拟合性，从而证实了模型的有效性。

2.3 产物的定性分析及纯度

对分离纯化后的产物进行甲酯化，利用气相色谱检测出脂肪酸中乙酸的总含量为65.93%；利用脂肪酶RMIM对产物进行专一性切割，纯化后得到2-单甘酯，再对其进行甲酯化，利用气相色谱测得2-单甘酯所含脂肪酸中乙酸的含量为10.01%，通过计算可知Sn-2位的乙酸含量为产物中脂肪酸总量的3.33%，又已知脂肪酸中乙酸总量为65.93%，所以Sn-1,3位所含乙酸含量为62.60%。若Sn-1位上的脂肪酸全部为乙酸（33.33%），则余下的乙酸在Sn-3位上即含量为29.30%，此时所得到的提纯产物中SLS型结构脂质的最小含量为87.99%；若Sn-1,3位所含乙酸含量相同（31.30%），此时得到的SLS型结构脂质最大含量为93.99%，因此，经纯化后的产物中一定存在SLS型结构脂质并且含量在87.99%～93.99%之间。对产物进一步进行纯度检测，得出SLS型结构脂质的纯度为90.3%。

2.4 大豆油脂处理前后的检测指标

表4 大豆油处理前后的检测指标Table4 Sensory and physiochemical indicators of soybean oil and SLS-type structured lipid

由表4可知，经过超临界CO2制备的SLS型结构脂质，其检测指标均未发生明显变化，实验结果表明其各项理化指标完全符合行业生产应用要求，具有良好的应用性。

3 结 论

本实验是在超临界条件下利用酯交换法制取低能SLS型结构脂质，通过响应面法优化分析得到乙酸乙酯转化的最优条件：酶用量2.9%、反应时间13.1 h、反应压力9.4 MPa、反应温度49.0 ℃。在此最优条件下进行酯交换反应，得到的乙酸乙酯转化率为36.1%，经分子蒸馏纯化后得到纯度为90.3%，热值为22.35 kJ/g的SLS型结构脂质，其热值为普通大豆油的58%，达到了降低热值的目的，可为以后工业化生产低能油脂提供依据。

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Process Optimization for Synthesis of Low-Energy SLS-Type Structured Lipid by Transesterifi cation in Supercritical CO2State Using Response Surface Methodology

ZHANG Jiaming, XU Duoxian, LI Xiangxin, QI Xiaofen, ZHANG Xu, YU Dianyu*
(School of Food Science and Technology, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

In the supercritical CO2state, the synthesis of lipid with SLS-type structure from the Rhizomucor miehei lipase (Lipozyme RMIM)-catalyzed reaction between ethyl acetate and fi rst-grade soybean oil was investigated. The effects of enzyme concentration, reaction pressure, temperature and time on the conversion rate of ethyl acetate were examined by the combined use of single factor design and response surface methodology. The results showed that the optimal parameters for preparing SLS-type structured lipid were determined as follows: in the presence of 2.9% lipase RMIM, reaction at 49.0 ℃and 9.4 MPa for 13.1 h. Under these conditions, the conversion rate of ethyl acetate reached 36.1% and after purifi cation of the fi nal product, a purity of 90.3% and a caloricity of 22.35 kJ/g (reduced by 42% as compared with that of ordinary soybean oil) were obtained.

supercritical CO2; lipase; structured lipid; ethyl acetate conversion rate

TS224.8

A

1002-6630（2015）20-0067-06

10.7506/spkx1002-6630-201520012

2015-02-09

东北农业大学大学生SIPT计划项目（201410224036）

张家明（1992—），男，本科，研究方向为食品科学与工程专业。E-mail：1742186793@qq.com

*通信作者：于殿宇（1964—），男，教授，博士，研究方向为粮油精深加工技术。E-mail：dyyu2000@126.com