核桃青皮中多酚的超高压提取工艺优化

宋丽军 侯旭杰 李雅雯 张 丽（1.塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔 8400；2.南疆特色农产品深加工兵团重点实验室，新疆阿拉尔 8400；.南疆食品检验所，新疆 阿拉尔 8400）

核桃青皮，又称青龙衣，是核桃加工过程中的副产物，据统计［1］，截止2010年底，新疆核桃青皮产量已达到13.41万t。核桃青皮中含有丰富的多酚类化合物，如绿原酸、香草酸、槲皮素、没食子酸、核桃酮等［2－4］，具有较强的抗氧化活性，有抗衰老、治疗心脑血管疾病、降血脂、抗癌、抗辐射等生理功能［1，5］。但长期以来，核桃青皮均作为废渣抛弃，造成了极大的环境污染和资源浪费。

赵国建等［6］分别比较了溶剂提取法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法、六偏磷酸钠（SHMP）辅助提取法对核桃青皮多酚的提取效果，其中SHMP辅助提取法效果最佳，多酚得率为4.01mg/g，且需在70℃继续提取120min；房祥军等［7］采用50%丙酮—水溶液提取多酚得率为4.71%，但需连续提取3次，总提取时间达到4.5h。传统的提取方法普遍存在提取时间长、温度高、提取效率低等缺点。

超高压处理可以破坏物料的细胞壁、细胞膜等结构，促使细胞内容物和提取溶剂充分接触，加快提取速度，具有提取率高、提取温度低，以及可避免热效应引起的有效成分损失和生理活性降低等优点［8］。近年来，超高压提取技术已广泛应用于皂苷［8］、多糖［9］、茶多酚［10］、齐墩果酸［11］、茶树花精油［12］等生物活性成分的提取研究中，并取得了良好的效果，但有关核桃青皮多酚的超高压提取研究却未见报道。本研究拟采用超高压技术提取核桃青皮中的多酚类物质，采用响应面法优化多酚提取工艺，为核桃青皮多酚类物质提取提供新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

核桃青皮：新疆薄皮核桃温185核桃青皮，树龄21～23年，2012年10月2日购于新疆阿拉尔市。由于不同品种、生长期的核桃中多酚含量差异较大，本试验原料一次性采集。

福林—酚试剂、没食子酸：美国Sigma公司。

乙醇、无水碳酸钠等均为国产分析纯。

1.1.2 主要仪器设备

减压干燥箱：DHG－9101－1S型，上海鸿都电子科技有限公司；

恒温水浴锅：HH－S6型，上海博讯事业有限公司医疗设备厂；

粉碎机：FZ102型，北京市永光明医疗仪器厂；

台式高速冷冻离心机：Neofuge 15R型，北京阳光思特生物技术有限公司；

紫外可见分光光度计：UV－Mini1240型，日本岛津公司；

电子天平：MA110型，上海台衡仪器仪表有限公司；

超高压处理装置（图1）：HPP.L.2－600/0.6型，工作压力0～600MPa，工作温度－10～60℃，传压介质为水，天津市华泰森淼生物工程技术有限公司。

图1 超高压提取多酚示意图Figure 1 The schematic diagram of extra－high pressure extraction

1.2 方法

1.2.1 提取工艺

核桃青皮→预处理→减压干燥→粉碎、过筛→样品、溶剂混合→真空包装→预热、超高压处理（间歇加压提取两次）→离心→上清液→测定总多酚

操作要点：核桃青皮切分后于50℃减压干燥，粉碎，过80目筛，置于棕色瓶中密封，－18℃冷冻保藏备用。取5g粉末与50%乙醇—水混合，避光、真空包装，预热3min后采用超高压提取2次，两次加压间隔时间3min（包含升降压时间），离心后取上清液，测定总多酚含量。

1.2.2 多酚类定性试验 参照文献［5］。

1.2.3 总多酚测定 采用福林—酚法［6］。没食子酸标准溶液标准曲线为：y＝0.102 8x－0.008 4（R2＝0.998 6）。样品中的多酚以没食子酸的含量表示，单位为mg/g。多酚得率按式（1）计算：

式中：

R——多酚得率，mg/g；

m1——核桃青皮质量，g（干基）；

m2——核桃青皮提取液中多酚含量，mg（干基）。

1.2.4 单因素试验设计

（1）压力对多酚提取效果的影响：以50%的乙醇—水为提取溶剂，在保压时间5min、液料比30∶1（V∶m）、提取温度40℃条件下，分别设置提取压力100～600MPa，研究提取压力对多酚提取效果的影响。

（2）温度对多酚提取效果的影响：以50%的乙醇—水为提取溶剂，在提取压力300MPa、保压时间5min、液料比30∶1（V∶m）条件下，分别设置提取温度20～60℃，研究提取温度对多酚提取效果的影响。

（3）时间对多酚提取效果的影响：以50%的乙醇—水为提取溶剂，在提取压力300MPa、液料比30∶1（V∶m）、提取温度40℃条件下，分别设置提取时间2～7min，研究提取时间对多酚提取效果的影响。

（4）液料比对多酚提取效果的影响：以50%的乙醇—水为提取溶剂，在提取压力300MPa、提取温度40℃、提取时间5min条件下，分别设置液料比10∶1～60∶1（V∶m），研究液料比对多酚提取效果的影响。

以上试验均做3个平行，取平均值。

1.2.5 响应面优化试验 在单因素试验基础上，选取对核桃青皮多酚影响显著的因素，运用Design Expert 8.05软件，根据Box－Behnken试验设计原理，以多酚得率为响应值，进行响应面试验并对试验数据进行回归分析，优化核桃青皮多酚提取条件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 核桃青皮多酚提取液定性试验 由表1可知：定性试验均显示阳性结果，说明核桃青皮提取物中含有多酚类物质。

表1 核桃青皮提取液多酚类定性试验Table 1 Qualitative test of polyphenols extracted from walnut green peel

2.1.2 提取温度对多酚得率的影响 由于高温极易造成多酚类物质的损失，故本试验设定提取温度低于60℃。由图2可知，在超高压条件下，温度对多酚得率有显著影响。20℃时多酚得率为6.454mg/g，40℃时多酚得率为6.875mg/g，增幅为0.420mg/g。当温度大于40℃时，多酚得率增幅不显著。因此，后续试验提取温度选择40℃。

图2 提取温度对核桃青皮多酚得率的影响Figure 2 Effect of temperature on the extraction efficiency of polyphenols

2.1.3 提取压力对核桃青皮多酚得率的影响 由图3可知，当压力小于300MPa时，随着压力的增大，多酚得率迅速增加，增幅达到1.895mg/g；当压力大于300MPa时，随着压力的增加，多酚得率小幅度增加，增幅为0.210mg/g。本试验采用二次加压提取法，在升压和卸压过程中，对物料细胞造成极大的压力差，使细胞壁和细胞膜透通性发生变化，细胞内容物紊乱、外泄，增大了提取溶剂与有效成分的接触面积，降低了传质阻力，从而使其传质速率加快［8］，提高得率。考虑设备成本及效率，确定后续试验提取压力为300MPa。

图3 提取压力对核桃青皮多酚得率的影响Figure 3 Effect of pressure on the extraction efficiency of polyphenols

图4 提取时间对核桃青皮多酚得率的影响Figure 4 Effect of time on the extraction efficiency of polyphenols

2.1.4 提取时间对多酚得率的影响 由图4可知，提取时间对核桃青皮多酚得率有显著影响。当保压时间小于5min时，随着时间的延长，多酚得率显著增加，增幅达到1.883mg/g；当时间为5～8min时，多酚得率缓慢增加，增幅只有0.286mg/g。可能是在高压条件下，物料细胞内产生剧烈的涡流扩散，有效成分传质速率快，因此在较短时间内（5min）便可使细胞内部和外部的多酚浓度达到平衡；之后再延长保压时间，多酚也无法由细胞内部向提取溶液中扩散［8］。因此，后续试验选择保压时间为5min。

2.1.5 液料比对多酚得率的影响 多酚类化合物的提取过程由渗透、溶解、扩散几个步骤组成，其中扩散为最主要的作用。提取过程中，溶剂与原料的比值越大，则浓度梯度越大，多酚的扩散速率越大［13］。由图5可知：在液料比10∶1～30∶1（V∶m）范围内，随着溶剂量的增加，多酚得率由3.942mg/g增加到6.873mg/g，增幅达到2.991mg/g；当液料比大于30∶1（V∶m）时，增幅变缓，尤其是液料比大于40∶1（V∶m）时，多酚得率基本趋于稳定。考虑到液料比过大，不仅会消耗大量的溶剂，而且会降低提取液中有效成分的浓度，给后续分离纯化过程带来困难［10］。因此，后续试验选择液料比1∶30（m∶V）。

图5 液料比对核桃青皮多酚提取率的影响Figure 5 Effect of liquid ratio on the extraction efficiency of polyphenols

2.2 响应面优化试验

2.2.1 响应面试验设计与结果 在单因素试验基础上，选取温度、压力、时间、液料比4个因素，运用 Design Expert 8.05软件的Box－Behnken原理进行试验设计。各因素及水平见表2，试验设计及结果见表3。

表2 响应面设计因素水平表Table 2 Levels and codes of variables chosen for design

表3 响应面设计与试验结果Table 3 The experimental and predicted values of polyphenols extraction

以多酚得率为响应值（Y），利用Design Expert 8.05软件对表3数据进行二次多元回归拟合，得到响应值对自变量的多元回归方程（2）：

由表4可知：Fmodel＝49.61，P＜0.000 1，表明模型（2）极显著，R2＝0.980 2，AdjR2＝0.960 5，Adeq Precision＝27.068，说明该模型拟合程度良好，试验误差小，该模型可以用来分析和预测超高压提取核桃青皮多酚的效果。

表4 试验结果方差分析表Table 4 Analysis of variance for quadratic regression equation

表4 试验结果方差分析表Table 4 Analysis of variance for quadratic regression equation

＊表示0.05水平显著；＊＊ 表示0.01水平显著。

变异来源 平方和 自由度 均方 F值 Pr＞F 显著性模型 5.992 6 14 0.428 49.61 ＜0.000 1＊＊X10.029 2 1 0.029 2 3.385 0.087 1 X21.060 9 1 1.060 9 123.0 ＜0.000 1 ＊＊X30.933 5 1 0.933 5 108.2 ＜0.000 1 ＊＊X43.194 0 1 3.194 370.2 ＜0.000 1 ＊＊X1X20.000 3 1 0.000 3 0.033 0.857 4 X1X30.008 6 1 0.008 6 1.002 0.333 7 X1X40.018 0 1 0.018 2.081 0.171 1 X2X30.043 7 1 0.043 7 5.063 0.041 0 ＊X2X40.121 1 1 0.121 1 14.04 0.002 2 ＊X3X46E－05 1 6E－05 0.007 0.936 8 X21 0.159 3 1 0.159 3 18.46 0.000 7 ＊X22 0.138 2 1 0.138 2 16.02 0.001 3 ＊X23 0.087 4 1 0.087 4 10.13 0.006 6 ＊X24 0.453 2 1 0.453 2 52.53 ＜0.000 1 ＊＊残差 0.120 8 14 0.008 6失拟 0.111 6 10 0.011 2 4.855 0.070 7误差 0.009 2 4 0.002 3总和6.113 3 28

模型（2）中一次项 X2、X3和X4极显著，交互项 X2X3和X2X4显著，、和显著，极显著，其它不显著。对表2的数据进行回归分析，剔除不显著交互项，得到核桃青皮多酚得率（mg/g）对各自变量的标准回归方程（3）：

根据一次项自变量系数可知，各自变量对响应值的影响大小顺序为：X4（液料比）＞X2（压力）＞X3（时间）＞X1（温度）。

图6、7为压力和时间、压力和液料比对核桃青皮多酚提取效果的影响，通过等高线及响应面图可直观地反映出不同变量间交互作用的显著程度，等高线越扁平说明因素之间交互作用越显著，对多酚得率的影响越大。由图6、7可知：压力和时间交互作用、压力和液料比交互作用的等高线均呈现椭圆、扁平状，表示上述因素之间的相互作用显著。

图6 Y＝f（X2，X3）的响应面和等高线图Figure 6 Response surface and contours of Y＝f（X2，X3）

图7 Y＝f（X2，X4）的响应面和等高线图Figure 7 Response surface and contours of Y＝f（X2，X4）

2.2.2 验证实验结果 根据软件和模型进行参数优化分析，得到核桃青皮多酚超高压提取的最佳工艺条件为：温度42.19℃，压力309.09MPa，时间6.00min，液料比39.69∶1（V∶m），在此条件下预测得率为7.35mg/g。结合实际操作情况，将上述最优工艺调整为：温度42℃，压力310MPa，时间6min，液料比40∶1（V∶m）。在此优化工艺条件下，3次验证实验的多酚得率分别为7.31，7.45，7.49mg/g，平均值为7.417mg/g，验证值与预测值相对误差相差较小，说明了模型的有效性。

3 结论

本试验在单因素基础上，通过响应面法优化了超高压提取核桃青皮多酚的最佳工艺为：采用超高压二次提取法，以50%乙醇—水为提取液，粉碎粒度80目，温度42℃，压力310MPa，时间6min，液料比40∶1（V∶m），此条件下多酚得率为7.417mg/g。本研究的不足之处在于未对超高压条件下多酚类物质的传质机理及其动力学进行深入研究，下一步需针对上述问题进行深入探讨。

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