促红细胞生成素拟肽研究进展

董艳，徐为人，孔德新

促红细胞生成素拟肽研究进展

董艳1,2，徐为人1，孔德新2△

促红细胞生成素（Epo）是一种主要由肾脏合成并且分泌的活性糖蛋白，可刺激骨髓造血，主要用于治疗慢性肾功能衰竭导致的贫血性疾病，Epo口服不吸收，需静脉注射给药。由于其在人体内的生物半衰期较短，需要频繁注射，给患者在使用过程中带来很多不便并造成一定的经济负担。因此，开发疗效好、不良反应小且持续时间长的

红细胞生成素；红细胞生成素,重组；受体,红细胞生成素；贫血；促红细胞生成素拟肽

促红细胞生成素（Epo）是一种主要由肾脏合成并且分泌的活性糖蛋白，能够结合红细胞表面的Epo受体（EpoR），刺激红细胞增生、分化和成熟，进而使正常人体内红细胞的数量保持相对稳定，贫血患者体内的红细胞数量增加，促进血红蛋白的生成，改善贫血状况[1]。1985年Lin等[2]首先从人类基因库中分离Epo基因，测定其核苷酸序列，并应用基因重组技术在实验室获得重组人Epo（rhEpo）。1989年美国安进（Amgen）公司的第一个基因重组药物Epogen获得美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，用于治疗慢性肾功能衰竭导致的贫血、失血后贫血、恶性肿瘤或化疗导致的贫血等，取得了令人瞩目的疗效。应用rhEpo可减少输血次数，提高患者生活质量，但rhEpo在体内的生物半衰期较短，需大剂量频繁给药，给患者在经济及生活上带来诸多不便。目前市场上已有多种新型Epo以及Epo激动剂（erythropoiesis-stimulating agents,ESAs）类药物，如新促红血球生成蛋白(new erythropoietin stimulating protein,NESP)Darbepoietin alpha(Aranesp)，持续性促红细胞生成素受体激活剂（continuous erythropoietin receptor activator,CERA），促红细胞生成素拟肽（erythropoietin mimetic petide,EMP）等[3]，为临床治疗提供了更好的条件。本文就近年来有关Epo拟肽类药物的研究情况综述如下。

1 Epo分子特性以及Epo受体的结构

1.1 Epo分子特性人类Epo是一种含唾液酸的酸性糖蛋白，分子质量为30.4 ku，包括肽链和糖链两部分，肽链部分由165个氨基酸残基组成，其中蛋白质与糖类的比例为6:4。成熟的Epo分子含有4条糖链，3条位于Asn24/Asn38/Asn83位点上的N糖苷连接的酸性低聚糖侧链，1条位于Ser126位点上的O糖苷连接的酸性低聚糖侧链[4]。Epo分子的二级结构是在第7和161、29和33的半胱氨酸之间形成的2对二硫键，见图1。Epo的空间构象由二硫键连接形成4个稳定的反向平行α螺旋结构和两长一短的3个无规则卷曲区域连接组成，这种空间构象对维持Epo的生物活性是必需的。

Fig.1The primary structure of erythropoietin showing the circulating form of 165 amino acids图1 Epo氨基酸序列结构

1.2 EpoR结构1986年Sawyer等[5]从Friend病毒贫血株（FVA）细胞上鉴定出EpoR，它是由508个氨基酸残基组成的一种单链结构的跨膜蛋白，分子质量为66 ku，分为胞外区、跨膜区和胞内区，见图2。胞外区是由200个氨基酸组成的2个亚区，其中第一亚区含4个半胱氨酸残基，对于结合Epo并形成二聚体至关重要；第二亚区含有1个色氨酸-丝氨酸-任意氨基酸-色氨酸-丝氨酸（WSXWS）的保守结构，该结构是胞质激素受体结合位点的必需组分，对于Epo与EpoR特异性结合起重要作用。跨膜区由24个氨基酸组成，EpoR二聚体的形成是由跨膜区所决定。胞内区决定了Epo与EpoR结合后细胞内信号转导。

Fig.2The structure of erythropoietin receptor图2 EpoR结构

1.3 EpoR介导的信号转导机制Epo功能的发挥依赖于EpoR的信号转导机制，EpoR结合Epo后发生同源二聚化，形成二聚体后引起受体激活，从而引发JAK2/STAT5等信号蛋白的磷酸化[6]。EpoR介导的信号传导并不是单一的通路，磷酸化后的JAK2至少通过5种不同的通路进一步激活：（1）EpoR-JAK2-Stat5（信号转导子及转录激活子）通路。（2）EpoR-JAK2-PI3K（磷脂酰肌醇-3-激酶）通路。（3）EpoRJAK2-ERKs（胞外信号调节激酶-1,2）通路。（4）EpoR-JAK2-NF-κB（核因子-κB）通路。（5）EpoR-JAK2-Ras-MAPK（有丝分裂原活化蛋白激酶）通路等[6-7]。EpoR-JAK2-STAT3通路是最近新发现的细胞内信号转导途径，介导多种细胞因子的细胞内信号的活动，参与细胞的增殖、分化、成熟、细胞凋亡和免疫调节[8]。

1.4 EpoR的生理功能EpoR可表达于多种细胞如红系祖细胞、肿瘤细胞的表面，其结构决定了该受体所具有的功能，通过与Epo结合导致EpoR发生同源二聚化，形成同源二聚体后使受体激活，从而发挥Epo的生理作用。科学家们致力于研究一种可以导致EpoR发生同源二聚体化的小分子物质，这样就可能产生与Epo相似的生物活性，Epo拟肽的研究正是基于该原理逐步发展起来的。

2 蛋白质的糖基化以及作用

蛋白质的糖基化根据糖链的不同，可分为N-糖基化和O-糖基化：即通过糖链的还原端N-乙酰氨基葡萄糖和肽链中某些位点上的Asn侧链上的氮原子相连形成N-糖苷键[9]，以丝氨酸、苏氨酸、羟赖氨酸和羟脯氨酸的羟基为连接点，形成O-糖苷键[10]。糖基化是蛋白质翻译后的重要修饰过程，有影响多肽构像、调节蛋白质功能、增加蛋白质稳定性的作用[11]。Epo的糖基部分是3条分别与肽链中的24、38、83位点的天冬酰胺残基连接的N糖苷酸性低聚糖侧链和1条与126位点上的丝氨酸连接的O糖苷侧链[4]。糖基的存在对于Epo合成后的分泌以及发挥其在体内的生物活性都具有重要意义，其中最重要的糖基是唾液酸，去除唾液酸或糖基化的Epo半衰期缩短，体内活性丧失，因此糖基化对于维持Epo的稳定性及生物学功能具有重要的意义。

3 EMP代表药物

3.1 EMP-1EMP是1996年Wrighton和Farrell等[12]采用噬菌体文库技术从肽库中筛选出来的模拟Epo活性的短肽，被命名为EMP-1（序列：GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG），其分子质量远小于Epo，它是一种环状低聚肽，其20肽的氨基酸序列与天然或重组Epo无同源性，但可以与受体构成化学计量比为2∶2的复合体，在体外实验和动物实验中表现出与Epo类似的生物学特性[13],如特异性刺激具有EpoR的细胞系FDCP/EpoR，刺激人类骨髓和外周血红细胞集落形成，诱导相同的信号传导途径并可与Epo竞争结合受体等。在此基础上，人们通过修饰末端来进一步提高短肽的生物学效应，例如聚乙二醇（PEG）修饰的EMP-1二聚体与化学偶联二聚体明显提高了与受体的亲和力以及刺激细胞增殖的能力[14]。

3.2 PeginesatidePeginesatide是一种合成的聚乙二醇化二聚短肽化合，属于ESAs，由于它的氨基酸序列与天然或重组Epo的氨基酸序列无同源性[15]，因此不能诱导抗内源性Epo交叉反应的免疫应答，同时也会降低一系列由rhEpo引起的纯红细胞再生障碍性贫血（pure red cell aplasia,PRCA）并发症的风险，适用于有Epo禁忌证的患者，也可能用于抗Epo抗体导致的PRCA治疗。体外实验研究表明在大鼠体内网织红细胞和血红蛋白水平与给药剂量存在相关性[16]。在健康志愿者体内研究表明，单一剂量给药后，Peginesatide对于提高网织红细胞和血红蛋白含量是有效的，并且这种药效持续了1个月。和已经上市的重组蛋白药物相比，Peginesatide表现出更好的稳定性和更长的作用持续时间。Peginesatide最大的优势在于患者只需每月注射1次；而Epogen则需每月注射多达12次。Macdougall等[17-18]研究了983例非透析慢性肾疾病患者，通过对比另一种促红细胞生成素激动剂darbepoetin进而对Peginesatide修复肾性贫血的药效和安全性做了评估，结果表明Peginesatide（每月给药1次）与darbepoetin（每2周给药1次）在提高并维持血红蛋白水平发挥的药效作用相似，然而Peginesatide组的心血管疾病的病死率和心律失常以及不稳定型心绞痛的发生率都明显增加。Peginesatide于2012年3月27日获FDA批准上市，用于治疗因接受透析而引起贫血的慢性肾脏疾病的成年患者。据生产商的上市后报告，自该药获批后，25 000例患者接受了该药物治疗，其中大约有0.2%发生了过敏反应，这些患者中1/3（包括19例过敏性休克和其他严重不良事件在内）均需要及时的医疗干预，有时甚至需住院治疗。3例致死性反应占所有接受Peginesatide治疗患者的0.02%。FDA接受的这份不良反应报告显示，严重的过敏性反应发生在首次静脉给药后30 min内，但在之后的用药中或完成透析后并没有发生[19]。FDA表示，临床医生和透析中心应立即停止使用Peginesatide，并将药品返回给武田制药公司。最终，Peginesatide因产生速发型过敏反应与严重低血压等不良反应而撤出市场[20]。

3.3 CNTO 528和CNTO 530CNTO 528是1条含有20个氨基酸的EMP-1融合人类免疫球蛋白G1（IgG1）重链，结合EpoR在动物模型或人体内发挥强大的血红蛋白反应。在体外实验的基础上分析EMP-1结合EpoR主要依赖于2个疏水性氨基酸（Tyr-4和Trp-13），但只有第4位的Tyr残基是模拟多肽活性所必需的[21]。CNTO 528的半衰期长达7 d，是rhEpo活性的2倍。

CNTO 530是CNTO 528的后续产品，其分子质量为57 ku，半衰期长达40 d，是一种新型的长效促红细胞生成素受体激动剂，含有2条EMP-1序列作为药效基团的新型药物结构，它模拟EPO的药理作用，结合EpoR并刺激红细胞的生成。Makropoulos等[22]通过在镰状细胞性贫血的小鼠模型实验中发现，CNTO 530可以提高胎儿血红蛋白（HbF）在镰状细胞性贫血小鼠体内的表达，小鼠体内进行的研究表明，CNTO 530可以增加红细胞的数量和血红蛋白的含量。

CNTO 530包含人免疫球蛋白G4（IgG4）的Fc结构域[23]。抗体的Fc结构域结合到FcRn的内皮细胞的受体上介导内化和抗体再循环，从而导致血清半衰期延长[24]。在人类的UT-7EPO细胞内，CNTO 530引起EpoR相关的信号转导蛋白磷酸化。CNTO 530在人类UT-7EPO细胞的分子药理学以及在小鼠体内药代学和药效学研究数据表明：使用CNTO 530来治疗人类贫血将是一种非常有效的方法，但目前该药物并未进入临床试验[25]。

3.4 AGME400(HES)AGME400的基本结构与EMP-1的氨基酸序列有三处不同，它是以BB68作为基本序列(BB68序列结构：Ac-GGTYSCHFGKLT-Nal-VCKKQRG-Am，其中6,15位的2个半胱氨酸之间形成二硫键），2条BB68聚合成的一种新型的EMP二聚体（AGME400），最终与羟乙基淀粉（HES）结合形成共轭化合物。BB68是通过TF-1 MTS试验从数百条多肽中筛选出来的活性最强且与EMP-1结构不同的1条多肽[12,26]。将AGME400结合到HES上是为了提高多肽药物在体内的半衰期，同时也增强了多肽在体外试验中的药效，Kessler等[26]在人类的TF-1及UT-7EPO细胞中对BB68、AGME400以及AGME400（HES）进行了药效比较，结果表明AGME400的药效是BB68的100倍，AGME400的半数有效浓度（EC50）与Epo很接近，而AGME400（HES）的EC50明显低于AGME400。体外试验显示该化合物的药效优于Peginesatide，可与CNTO 530的药效相媲美[19,27]。经过多次体外实验分析，AGEM400(HES)疗效优于单独肽链的作用，且与Epo和Aranesp(Darbepoietin alpha)的疗效相差无几。AGEM400 (HES)与Epo或其他Epo类似物的作用机制相似，竞争性结合Epo受体，引起多功能转录因子Stat-5和细胞外信号调节激酶（ERK）信号蛋白在UT/Epo细胞中发生磷酸化，从而发挥药效[26]。

4 展望

促红细胞生成素具有显著提高人体内红细胞的数量，改善慢性肾衰性贫血等症状，但rhEpo体内半衰期较短，应用其治疗需大剂量频繁给药。Epo拟肽类药物的出现弥补了现有促红细胞生成素类药物的不足，随着对Epo拟肽的深入研究，慢性肾衰性贫血病的治疗模式将会向更具挑战性的有利方向发展。

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（2014-07-27收稿2014-08-29修回）

（本文编辑李国琪）

Research progress in erythropoietin mimetic peptides

DONG Yan1,2,XU Weiren1,KONG Dexin2△
1 Tianjin Key Laboratory of Molecular Design and Drug Discovery,Tianjin Institute of Pharmaceutical Research,Tianjin 300193,China;2 College of Pharmacy,Tianjin Medical University

Erythropoietin(EPO)is an active glycoprotein synthesized by kidney.The physiological function of regulating the synthesis of erythrocytes by EPO makes it as a clinical drug for treatment of anemia resulted from chronic kidney failure.However,its short biological half-life makes frequent administration,which limits its wide clinical utility since the tough burden and pain on patients.Therefore,the development of EPO derivatives with good efficacy,less adverse reaction and long duration has been a hot spot in the field during several decades.There are currently many different variants of EPO derivatives including erythropoiesis stimulating agents(ESAs)on the market.This article aims to summarize the recent research progress in the development of erythropoietin derivatives,specially focusing on EPO mimetic peptides(EMP).

erythropoietin;erythropoietin,recombinant;receptors,erythropoietin;anemia;erythropoietin mimetic peptide

R556

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2015.01.027

天津市应用基础及前沿技术研究计划（12JCYBJC18800）

1天津药物研究院天津市新药设计与发现重点实验室（邮编300193）2天津医科大学药学院

董艳(1990)，女，硕士在读，主要从事药学研究

△审校者

Epo一直是研究热点，目前市场上出现了多种新型的促红细胞生成素类药物，其中Epo拟肽的相关研究一直备受人们的关注，本文综述了近年来有关Epo拟肽类药物的研究情况。