胱硫醚β合成酶基因T833C多态性与新疆哈、汉民族原发性高血压的相关性研究

张蕾，蔡伟娟，张丽翠，张红梅，潘泽民，程江△

胱硫醚β合成酶基因T833C多态性与新疆哈、汉民族原发性高血压的相关性研究

张蕾1，蔡伟娟1，张丽翠1，张红梅1，潘泽民2，程江1△

目的探讨血浆同型半胱氨酸（Hcy）及胱硫醚β合成酶（CBS）基因T833C多态性与新疆哈萨克族（哈族）、汉民族原发性高血压（EH）的相关性。方法选取哈族239例EH患者（哈族EH组）和206例血压正常者（哈族对照组），汉族256例EH患者（汉族EH组）和224例血压正常者（汉族对照组）为研究对象，采用全自动生化分析仪检测4组受试对象血浆中Hcy水平及相关生化指标，采用扩增阻碍突变系统（ARMS）法检测4组受试者CBS基因T833C多态性，分析Hcy、CBS基因T833C多态性与EH的相关性。结果新疆哈族、汉族EH患者血浆Hcy水平均显著高于正常对照组（P＜0.05），哈族EH组C等位基因频率明显高于哈族对照组（P＜0.05），且哈族、汉族TT基因型个体血浆Hcy水平显著低于TC基因型个体（P＜0.05）；汉族EH组及汉族对照组T、C等位基因频率及TT、TC基因型频率差异均无统计学意义。结论CBS基因T833C多态性与新疆哈族EH的发生存在相关性，与汉族EH的发生可能无相关性，其机制可能与CBS基因突变改变了Hcy的代谢有关。

高同种半胱氨酸血症；胱硫醚β合酶；多态现象,遗传；高血压；汉族；哈萨克族

原发性高血压（essential hypertension,EH）是由多种病因引起的处于不断进展状态的心血管疾病，其致病因素受遗传与环境因素影响较大。近些年，大量研究表明高同型半胱氨酸（hyperhomocysteinemia,Hcy）血症是心脑血管疾病发生的独立危险因素[1]。胱硫醚β合成酶（cystathionine β synthase,CBS）是同型半胱氨酸代谢过程中的关键酶，当其存在缺陷时可导致同型半胱氨酸水平升高，进而导致高血压[2-3]。新疆哈萨克族（哈族）是高血压的高发人群，本研究通过检测血浆Hcy水平及CBS T833C位点基因多态性，探讨其与新疆哈族EH的相关性，为阐明新疆哈族高血压遗传机制提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2012年9月—2014年5月在新疆石河子大学医学院第一附属医院心内科住院的哈族、汉族EH患者，同时选取同时期门诊健康体检者为对照组。不同民族2组间年龄、性别差异无统计学意义，见表1。高血压组入选标准符合1999年WHO/ISH高血压诊断标准，并排除继发性高血压、心肌病、糖尿病等患者；对照组入选标准：收缩压（SBP）＜140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）和舒张压（DBP）＜90 mmHg，未服用降压药物，无高血压家族史，排除肝肾、甲状腺、糖尿病等疾病。

Tab.1Comparison of baseline characteristics between hypertension group and normotensive表1 不同民族2组间一般资料比较

1.2 血压测量所有研究对象均经静息15 min后由同一研究人员采用符合计量标准的台式水银柱血压计测量右侧肱动脉血压，连续测量3次，每次间隔至少2 min，取平均值。

1.3 体质指数（BMI）计算所有受试者均赤足、免冠、穿单衣测量身高、体质量，计算BMI，BMI=体质量/身高2（kg/m2）。

1.4 标本采集研究对象均空腹12～14 h，抽取肘正中静脉血6 mL置于EDTA抗凝管中，置-80℃保存，另取静脉血4 mL置于肝素抗凝管中，1 h内2 500 r/min离心10 min，取血清，用于生化指标的检测。

1.5 生化指标的测定采用日立7170全自动生化分析仪测定血清三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白的胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、空腹血糖（FBG）、同型半胱氨酸（Hcy）。

1.6 基因分型

1.6.1 外周DNA提取用AxyPrep血基因组DNA小量制备试剂盒提取白细胞中的DNA，严格按照试剂盒操作，提取后的DNA保存于-20℃。

1.6.2 引物设计与合成引物序列参考文献[4]，由上海生工公司合成。上游引物P1引物序列5′-GGAGAAGTGTCCTGGATGCA-3′；P2引物序列5′-CCCTTCGGGATCCACCCCAA-3′（野生型）；P3引物序列5′-CCCTTCGGGATCCACCCCAG-3′（突变型）。

1.6.3 基因突变检测方法利用扩增阻碍突变系统（ARMS）法检测CBS基因T833C位点基因突变。采用PCR扩增CBS基因T833C位点野生型目的片段：扩增体系总体积为25 μL，其中2×PCR Mix 12.5 μL，P1、P2引物各0.5 μL，模板DNA 3 μL，双蒸水8.5 μL；PCR扩增CBS基因T833C位点突变型目的片段：扩增体系总体积为25 μL，其中2×PCR Mix 12.5 μL，P1、P3引物各0.5 μL，模板DNA 3 μL，双蒸水8.5 μL；应用日本TaKaRa公司全自动PCR扩增仪，野生型、突变型片段扩增条件均为94℃预变性4 min，然后94℃变性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸30 s，循环35次，72℃延伸10 min。

1.6.4 基因型判断分别取上述PCR扩增产物10 μL加10×Buffer 2 μL，点样于1.5%琼脂糖凝胶中，100 V，电泳30 min后，在紫外灯下检测照相，经美国Bio-rad公司紫外凝胶成像分析系统观察片段电泳图，目的片段长度870 bp。

1.7 统计学方法采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料数据均用表示，2组间比较采用t检验，计数资料采用χ2检验，以Hardy-Weinberg平衡法检测样本是否有群体代表性；各基因型、等位基因频率间的比较运用χ2检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 哈、汉两民族EH组和对照组一般临床资料比较哈族EH组SBP、DBP、TC、LDL-C、FBG、Hcy均高于对照组，HDL-C低于对照组，差异有统计学意义（均P＜0.05）；2组BMI、TG差异无统计学意义。汉族EH组患者SBP、DBP、TC、TG、FBG、Hcy均高于对照组，2组BMI、HDL-C、LDL-C差异无统计学意义，见表2、3。

2.2 CBS T833C基因型的确定CBS T833C基因扩增的目的片段大小为870 bp，其核苷酸多态性可分为3种类型：野生型（TT型）、纯合突变型（CC型）、杂合突变型（TC型）。实际操作中每个个体均加2管，1、2为同一个体，3、4为同一个体，5、6为同一个体，7、8为同一个体。PCR产物直接检测分型得到2种基因型：野生TT型仅见870 bp 1个条带；杂合突变TC型可见870 bp 2个条带；纯合子突变型未检测到，见图1。

2.3 Hardy-Weinberg平衡检验对445例新疆哈族、480例新疆汉族人群进行Hardy-Weinberg平衡检验，结果显示差异无统计学意义（χ2分别为0.400、1.206，均P＞0.05），汉、哈两民族在遗传学上有较好的群体代表性。

2.4 基因分型结果比较新疆哈族EH组TT基因型比例低于哈族对照组，TC基因型高于哈族对照组（P＜0.05）；哈族EH组T等位基因频率低于哈族对照组，C等位基因高于哈族对照组（P＜0.05）。汉族EH组和对照组基因型、等位基因分布差异无统计学意义，见表4、5。

Tab.2Comparison of baseline characteristics between Kazak patients with hypertension group and normotensive表2 哈族EH组与对照组一般临床资料比较

Tab.3Comparison of baseline characteristics between Han patients with hypertension group and normotensive表3 汉族EH组与对照组一般临床资料比较

Fig.1The appraisal results of CBS T833C gene图1 CBS T833C基因型鉴定结果

Tab.4The result of T833C genotypes between Kazak patients with hypertension and normotensive表4 哈族EH组和对照组T833C位点基因分型结果

Tab.5The result of T833C genotypes between Han patients with hypertension and normotensive表5 汉族EH组和对照组T883C位点基因分型结果

2.5 CBS T833C不同基因型携带者血浆Hcy水平比较哈族TC基因型个体血浆Hcy高于TT基因型个体（P＜0.01）；汉族TC基因型个体血浆Hcy亦高于TT基因型个体（P＜0.01），见表6。

Tab.6The plasma levels of Hcy in differernt genotypes between Han patients and Kazak patients表6 哈族、汉族CBS T833C不同基因型携带者血清Hcy比较（μmol/L）

3 讨论

Hcy是人体中甲硫氨酸和半胱氨酸代谢过程的中间产物。近些年研究发现，Hcy水平升高可以造成血管内皮损伤,通过内质网应激增加caspase-3的活性诱导祖细胞的凋亡，致使动脉硬化，血管平滑肌增生[5]，进而导致高血压的发生。Nabipour等[6]研究发现绝大多数高血压患者伴有血浆Hcy水平的升高。Sengwayo等[7]通过对382例参与者的横断面研究发现，血浆Hcy水平和高血压有相关性。而Vaya等[8]发现高Hcy血症与高血压无相关性。欧洲11个国家共同完成的研究表明，Hcy水平的变化与血压水平密切相关[9]。本研究结果显示，哈族、汉族高血压组患者血浆Hcy水平高于对应的对照组（P＜0.01）,提示血浆Hcy水平可能与EH的发生有一定的联系。

CBS作为Hcy代谢途径中的关键酶之一，其位于第8外显子287密码子的T833C位点突变较常见，其编码的异亮氨取代苏氨酸后，致使CBS活性下降，导致Hcy活性受阻，造成Hcy在血中蓄积而产生高Hcy血症。Nienaber等[10]研究发现，在南非黑人中CBS基因T833C并没有显著影响Hcy的水平；Dutta等[11]对印度280例智力低下患者及健康者的病例对照研究发现，CBS基因T833C杂合突变基因型血浆Hcy水平低于野生纯合型血浆Hcy水平；宋宝强等[12]对570例缺血性脑血管病患者及健康者的病例对照研究发现，CBS基因T833C不同基因型之间血浆Hcy水平不同。因此CBS基因多态性具有种族差异，不同种族之间存在明显的遗传异质性。

新疆哈族群体极少与外界通婚，从地理位置及血缘上为相对隔离人群，有较大遗传同源性，影响血清高血压的环境因素比较一致。目前，对于新疆维族EH的发病机制尚不明确，是否受遗传因素的影响，目前鲜有研究报道。本研究结果显示，哈族EH组CBS基因T883C位点C等位基因频率显著高于哈族对照组（P＜0.01），哈族、汉族TC基因型个体血浆Hcy均高于TT基因型个体（P＜0.01）。而汉族两组TT、TC基因型和T、C等位基因频率分布差异无统计学意义。这表明CBS基因T883C多态性位点的等位基因频率分布与新疆哈族人群EH的发生有关，C等位基因可能性新疆哈族EH的危险因素，携带C等位基因的哈族个体更易发生EH,其机制可能是与CBS T833C基因突变，从而改变了Hcy的代谢有关，而该位点与新疆汉族EH的发病可能无相关性。

综上，CBS基因T833C多态性与新疆哈族EH的发生存在相关性，与汉族EH可能无相关性。本研究由于课题经费有限及病例收集难度大，样本量较小，各组均未检测到CC基因型的个体，今后将加大样本量，并采用多中心、大样本的研究。

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（2014-06-29收稿2014-09-12修回）

（本文编辑李国琪）

Association between cystathionine β synthase gene T833C polymorphism and essential hypertension in Xinjiang Kazakh population and Han population

ZHANG Lei1，CAI Weijuan1，ZHANG Licui1，ZHANG Hongmei1，PAN Zemin2，CHENG Jiang1△
Division of Clinical Laboratory,The First Affiliated Hospital,College of Medicine,Shihezi University, Xinjiang 832002,China；2 College of Medicine,Shihezi University△

ObjectiveTo investigate the association between plasma homocysteine(Hcy)levels and cystathionine β synthase(CBS)T833C gene polymorphism with essential hypertension in Xinjiang Kazakh and Han populations.Methods A total of 239 Kazak patients with hypertension(Kazak EH group),206 Kazak people with normal blood pressure(Kazak control group),256 Han patients with hypertension(Han EH group)and 206 Han people with normal blood pressure(Han control group)were selected for the study.Amplification refractory mutation system(ARMS)was used to analyze the polymorphism of CBS gene T833C，TT，TC and CC genotypes and the various sites of T，C allele frequencies in four groups.In the meantime,the Hcy level and related biochemical indices were detected using automatic biochemical analyzer.Results The plasma Hcy levels were significantly higher in Kazak EH group and Han EH group than those of Kazak control group and Han control group(P＜0.05).The C allele frequencies were significantly higher in Kazak EH group than that of Kazak control group(P＜0.05).The plasma level of Hcy was significantly lower in Kazakh and Han people with TT genotypes than that of TC genotypes(P＜0.05).There were no significant differences in the frequency of genotypes and alleles between Han EH group and Han control group(P＞0.05).ConclusionThe Cystathionine β synthase gene of T833C polymorphism may be associated with essential hypertension in Kazak people in Xinjiang,but no such association in Han population in Xinjiang.The mechanism may be related to the altered metabolism of Hcy induced by CBS mutation.

hyperhomocysteinemia;cystathionine beta-synthase;polymorphism,genetic;hypertension;Han nationality;Kazakh nationality

R544.11

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2015.01.003

国家高技术研究发展计划（863计划）资助项目（2011AA02A111）

1新疆石河子大学医学院第一附属医院检验科（832002）；2石河子大学医学院生物化学与分子生物学教研室

张蕾(1976)，女，副主任技师，主要从事原发性高血压发病机制的研究

△通讯作者E-mail：chengjiang1980@sina.com