不同消毒方法对TiO2涂层种植体抗菌性能的影响

宁佳，吕武龙，王磊，李长义

不同消毒方法对TiO2涂层种植体抗菌性能的影响

宁佳，吕武龙，王磊，李长义△

目的研究不同消毒方法对TiO2涂层种植体抗菌性能的影响。方法纯钛表面经0.5%质量分数的氢氟酸酸蚀后阳极氧化，制备TiO2涂层试样作为实验组，以未经处理的纯钛试样作为对照组。采用乙醇浸泡、高压蒸汽灭菌、紫外线照射3种消毒方法处理试样。观察试样表面形貌，测量试样表面粗糙度及消毒前后去离子水在试样表面接触角，评价试样的细菌黏附能力；采用薄膜密着法进行活菌计数，验证经3种消毒方法处理后，试样抑制金黄色葡萄球菌的功效；采用场发射扫描电镜观察3种消毒方法对细菌形态的影响。结果与对照组试样相比，实验组的表面粗糙度更大，对细菌黏附能力更强。经紫外线照射消毒后，试样表面接触角小于乙醇浸泡消毒和高压蒸汽灭菌。活菌计数和场发射扫描电镜观察显示，乙醇浸泡消毒后，试样表面活菌数最多，细菌形态较完整；高压蒸汽灭菌后，试样表面活菌数较少，细菌形态受到一定程度破坏；紫外线照射消毒后，试样表面活菌数最少，细菌形态破坏最完全。结论经紫外线照射消毒后，试样的抗菌性能最佳，高压蒸汽灭菌次之，乙醇浸泡消毒效果最差。

灭菌；消毒；牙科合金；钛；葡萄球菌，金黄色；TiO2涂层；抗菌

种植体表面阳极氧化制备TiO2纳米管经体外及动物实验显示出早期骨诱导作用[1-2]，具有良好的应用前景。但制备过程改变了种植体表面形貌，易造成表面生物膜的形成和种植体-组织界面免疫能力低下，出现种植体周组织感染等并发症[3]。种植前消毒能够抑制种植体表面生物膜的形成，提高种植成功率。目前关于消毒方法对TiO2涂层种植体抗菌性能的影响尚少见报道。本研究对纯钛试样及TiO2涂层试样接种金黄色葡萄球菌，探求乙醇浸泡消毒、高压蒸汽灭菌、紫外线照射消毒对试样抗菌性能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验仪器高压直流电源(DW-P401-40AC，天津市东文高压电源厂)；磁力加热搅拌器(CJJ78-1，江苏金坛城西晓阳电子设备厂)；高压蒸汽灭菌锅（E6-18/24，EURONDA）；Talor Hobson表面粗糙度仪（Taylorsurf 60，UK）；接触角测量仪（JGW-360A，厦门崇达智能科技有限公司）；紫外线灯管（K8W，Philips）；超净工作台（FLC-3，哈尔滨市东联公司）；恒温箱（NE6000,天津市中环实验电炉有限公司）；场发射扫描电子显微镜（S-4800，HITACHI）。

1.2 药品与试剂纯钛试样（直径15 mm，厚度0.5 mm，陕西宝鸡钛业有限公司）；氢氟酸（HF），分析纯（天津市赢达稀贵化学试剂厂）；无水丙酮；无水乙醇；去离子水；PBS缓冲液（Solaibio）；牛心脑浸液培养基（brain heart infusion,BHI,Oxoid）。金黄色葡萄球菌（ATCC25923）。

1.3 覆盖膜采用聚乙烯薄膜，裁剪成3.0 cm×3.0 cm方形薄片。实验前用75%的乙醇溶液浸泡消毒1 min，无菌水漂洗，自然干燥备用。

1.4 样品制备对照组：纯钛试样。经碳化硅砂纸序列打磨至1 500目，分别用丙酮、乙醇和去离子水超声清洗10 min，室温下自然干燥，取40个样品作为对照组。实验组：TiO2涂层试样。方法为随机抽取按照对照组方法处理的试样40个，在0.5%质量分数的HF溶液中酸蚀30 min后立即用去离子水冲洗晾干；然后在0.2%质量分数的HF电解液中，以20 V电压阳极氧化处理40 min。处理过程中始终用电磁搅拌，保持电解液的均匀和温度恒定。阳极氧化处理结束后，用去离子水冲洗并超声清洗，室温下自然干燥。

1.5 样品消毒2组分别以高压蒸汽灭菌（134℃，0.14～0.18 MPa）、乙醇（75%）浸泡、紫外线（20 W）照射消毒，消毒时间均为1 h。对照组和实验组分别再分为未消毒亚组、高压蒸汽灭菌亚组、乙醇浸泡消毒亚组、紫外线照射消毒亚组，每亚组各10个试样。

1.6 试样表面特性检测采用场发射扫描电子显微镜观察2组试样表面形貌。采用Talor Hobson表面粗糙度仪测试2组试样表面粗糙度。采用轮廓算术平均偏差(Ra)、微观不平度十点高度(Rz)来评价表面粗糙程度。取3种消毒方法及未消毒的试样每组各10个，室温下将去离子水10 μL滴于试样表面，用接触角测量系统采集图像并测量接触角。

1.7 菌液配置将冻存的金黄色葡萄球菌解冻接种于牛心脑浸液琼脂平板培养基上，37℃需氧培养24 h，用无菌接种环挑取单菌落接种于BHI液体培养基中，采用麦氏比浊法配制1×106cfu/mL的菌液待用。

1.8 抗菌效能检测参考《抗菌塑料—抗菌性能试验方法和抗菌效果》（QB/T 2591—2003），采用薄膜密着法进行抗菌实验[4]。将2组的3种消毒方法各3个试样放入12孔培养板内，分别吸取10 μL菌悬液滴加在各试样表面，覆盖聚乙烯薄膜并平铺，使细菌均匀接触试样并减少菌液挥发，37℃恒温箱培养1 h后将试样及薄膜放入9.99 mL的BHI液体培养基中，超声震荡1 min后将菌液倍比稀释，分别取100 μL接种于BHI琼脂平板，用L型涂抹棒在平板上涂匀，平放20 min后倒转，于37℃恒温箱培养24 h后进行菌落计数。

1.9 细菌形态观察取2组试样每种消毒方法各1个，进行上述抗菌实验，培养终止后，PBS漂洗，加入2.5%戊二醛4℃浸泡12 h，之后乙醇梯度脱水，干燥。场发射扫描电镜观察细菌形态。

1.10 统计学方法采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，计量资料以表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 试样表面形貌观察在100 μm级别的电镜图片上可以观察到，对照组试样表面较为平整光滑，实验组试样后有较大的沟壑样突起，坑窝边缘较为圆钝，见图1A、B。在500 nm级别的电镜图片上，可观察到对照组表面仍较为平整；实验组有均匀的TiO2纳米管结构，管径约100 nm，见图1C、D。

Fig.1The morphology of experimental group and control group图1 实验组及对照组试样表面形貌

2.2 表面粗糙度测定与对照组相比，实验组Ra和Rz明显增大（P＜0.05），见表1。

Tab.1The roughness in two groups表1 表面粗糙度（n=10,μm，）

Tab.1The roughness in two groups表1 表面粗糙度（n=10,μm，）

＊P＜0.05

组别对照组实验组t Ra 0.12±0.02 0.91±0.11 22.026＊Rz 0.92±0.21 5.72±0.66 21.958＊

2.3 接触角经3种消毒方法处理后，实验组接触角均小于对照组。乙醇浸泡消毒后2组试样表面接触角变小，高压灭菌后2组试样表面触角明显增大，紫外线照射消毒后2组试样表面接触角明显变小，见表2。

Tab.2Contact angles in two groups表2 接触角（n=10，°，x±s）

2.4 抗菌效能乙醇浸泡消毒后，细菌存活数最多，高压蒸汽灭菌后，细菌存活数较少，紫外线照射消毒后，细菌存活数最少。3种消毒方法处理后，TiO2涂层试样的细菌存活数均少于纯钛试样，见表3。

Tab.3Viable count of Staphylococcus aureus表3 金黄色葡萄球菌活菌菌落计数（cfu/mL，）

Tab.3Viable count of Staphylococcus aureus表3 金黄色葡萄球菌活菌菌落计数（cfu/mL，）

＊P＜0.05；a与乙醇浸泡消毒比较，b与高压蒸汽灭菌比较，P＜0.05

组别对照组实验组t n F 10 10乙醇浸泡消毒237±9 221±16 2.729＊高压蒸汽灭菌212±13a158±10a10.460＊紫外线照射消毒195±8ab101±7ab26.741＊40.749＊247.810＊

2.5 试样表面细菌形态观察经紫外线照射消毒处理后，细菌形态破坏最严重；高压蒸汽灭菌处理后，细菌形态受到一定程度破坏；乙醇浸泡消毒后，细菌形态较为完整。2组试样相对比，TiO2涂层试样的细菌形态破坏更严重，经紫外线照射消毒的效果尤为明显，见图2。

Fig.2The morphology of Staphylococcus aureus on specimens（SEM,×50 000）图2 试样表面金黄色葡萄球菌形态（SEM,×50 000）

3 讨论

细胞所处的细胞外基质环境不仅包括微米尺度形貌，而且包括大量的纳米尺度形貌，因此，制备具有纳米和微米尺度混合表面形貌种植体表面可为细胞提供更适合附着与黏附的仿生环境[5]，促进成骨细胞活性[6]，有利于实现早期骨结合并增加结合强度，减少种植体周围炎的发生[7]。酸蚀后的微米形貌已经被广泛认为可以促进种植体骨结合，在微米形貌上通过阳极氧化进一步得到了高度有序、垂直排列、相互平行的TiO2纳米级管状形貌，能够很好地模拟体内骨细胞生长的纳米尺寸环境[8]。和光滑纯钛相比，本实验所制备的试样表面坑窝边缘圆钝，能够更好地模拟骨组织中细胞外基质的的结构，从而更适合种植体骨结合。

本研究应用的消毒方法为种植体常用的高压蒸汽灭菌、乙醇浸泡和紫外线照射[9]。金黄色葡萄球菌是口腔术后常见的感染致病菌，材料及药物抗菌性能相关研究多以此菌为主，因此作为本研究用菌。

细菌生物膜在材料表面的附着与材料表面特性如亲水性、表面能和粗糙度有关。表面粗糙度越大，则表面越粗糙，有利于细菌附着。本研究中经表面处理的实验组粗糙度较对照组明显增大，Ra值达到0.82 μm以上，与金黄色葡萄球菌的直径相似，有利于细菌的定植和黏附。而消毒方法对材料表面特性的改变会影响细菌与材料的相互作用[10]。本实验中，紫外线消毒较乙醇浸泡和高压灭菌消毒试样表面接触角明显减小，其原因可能是紫外线照射改变了材料表面的化学成分，其产生的Ti-OH基团去除了试样表面的疏水性污染物如碳氢污染[11]。

生物材料的消毒方法会影响材料的表面特性进而影响其生物活性。TiO2在紫外光的照射下可以使价带上的电子(e-)被激发跃迁至导带，在价带上产生相应的空穴(h-)，并可在电场下分离、迁移到粒子表面，进而与吸附在表面的物质发生一系列氧化还原反应，从而发挥其抗菌作用[12]。本实验结果显示，紫外线照射后较高压灭菌和乙醇浸泡消毒试样表面存活细菌数量明显减少，结合粗糙度和接触角结果，TiO2涂层试样表面黏附细菌数量多于纯钛试样，但由于试样表面在紫外线照射下产生了氧化性较强的活性基团，有效分解并杀灭细菌。因此，紫外线照射酸蚀后的TiO2纳米管对细菌具有更好地杀灭作用。

实验中扫描电镜结果显示，紫外线消毒的试样表面细菌形态发生明显变化，大部分变形、裂解甚至死亡，这与抗菌效能检测实验结果相符，说明紫外线消毒具有较强的抗菌性能。TiO2涂层试样较纯钛试样表面细菌形态皱缩更明显，提示紫外线照射后的酸蚀TiO2纳米管具有更强的抗菌性能。

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（2014-01-28收稿2014-08-04修回）

（本文编辑魏杰）

Effects of different disinfection methods on antibacterial activity of TiO2nanotubes

NING Jia,LYU Wulong,WANG Lei,LI Changyi△
The Stomatological Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China△

ObjectiveTo study the influence of different kinds of disinfection methods on antibacterial activity of TiO2nanotubes.MethodsTiO2nanotubes were fabricated with 0.5%wt HF on pure titanium to acid-etching combined with an-odization as experimental group.The pure Ti was control group.They were disinfected by three kinds of disinfection methods,which were alcohol immersion,autoclaving and UV irradiation.The bacterial adhesion ability was evaluated by observing the morphology of samples,measuring the roughness and contracting angle.The film contact method was used to evaluate the antibacterial activity of samples with Staphylococcus aureus(Sa)after different infection treatment.The bacterial morphology was observed by field emission scanning electron microscope(FE-SEM).ResultsThe treatment group has higher surface roughness.The bacterial adhesion ability of experimental group was stronger compared with that of control group.The contracting angle of samples exposed to UV irradiation was smaller than that of alcohol immersion and autoclaving treatment group.The viable count and FE-SEM showed that there were more bacteria and more complete morphology on the sample surface after alcohol immersion.The viable count was less and bacterial morphology suffered some damage on the sample surface after high pressure steam sterilization.The least viable count and the most complete destruction of bacterial morphology were found after ultraviolet(UV)germicidal irradiation.ConclusionUV irradiation shows the best antibacterial activity, the second is autoclaving and the worst is alcohol immersion.

sterilization;disinfection;dental alloys;titanium;staphylococcus aureus;TiO2nanotubes;antibacterial

R783.1

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2015.01.022

天津医科大学口腔医院（邮编300070）

宁佳(1988),女,硕士在读,主要从事口腔种植材料方面的研究

△通讯作者E-mail:Changyi_li@sina.com