SMART技术构建的辣椒疫霉菌与辣椒互作AD-cDNA文库

周志国 明月梅

（廊坊师范学院生命科学学院，河北廊坊 065000）

SMART技术构建的辣椒疫霉菌与辣椒互作AD-cDNA文库

周志国 明月梅

（廊坊师范学院生命科学学院，河北廊坊 065000）

为了分离和克隆辣椒中疫霉菌诱导基因，以接种辣椒疫霉菌的叶片为材料，利用SMART技术构建辣椒疫霉菌与辣椒互作的双杂交cDNA文库。结果表明：该文库容量为3.6×106cfu，重组率88%左右，插入片段集中在300～2 000 bp之间，平均长度约为800 bp，表明获得的文库质量较高，该文库将为分子育种提供重要的基因资源。

辣椒疫霉菌；SMART技术；双杂交cDNA文库

辣椒是我国重要的蔬菜和加工原料作物，产值居蔬菜之首（谢思惠 等，2011）。在辣椒生产过程中，病害种类多，发生频繁，其中疫病（Phytophthora blight）是重要的真菌性土传病害，发病快，蔓延迅速，病程期短，防治困难（杜晓华 等，2005），常造成辣椒大面积减产甚至绝收，在我国吉林、辽宁、青海、河北、北京、云南、甘肃、陕西、上海、浙江、湖南、江苏、江西等地均有发生（周启明 等，1984；关天舒 等，1995；邹学校 等，2004）。研究人员已对辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）的生理与致病机理、辣椒的疫病病理、栽培方式、化学防治、生物防治等方面进行了相关研究（田林 等，1989；朱英波和李超，2002；李智军 等，2007；刘学敏，2007；江厚春 等，2011），但抗病育种作为防治辣椒疫病的重要方法，其抗病资源相对缺乏（程芳，2007；史云国，2007；徐刘平和郭坚华，2007）。

cDNA文库是现代研究功能基因组学的最有效手段之一，可直接从cDNA文库中筛选所需目的基因，并用于基因的表达分析（Colin et al.，1999；蔡宁波 等，2007；朱利军 等，2009）。利用SMART技术（Switching Mechanism At 5′end of RNA Transcript）构建全长cDNA文库，可从中发现候选基因，从而在生产上实现转基因技术的广泛应用（张冲 等，2013）。为充分开发和利用辣椒抗病基因，本试验以辣椒为材料，利用SMART技术构建辣椒疫霉菌诱导的混合叶片Y2H的AD-cDNA文库，测定文库的滴度和重组率，并随机挑选50个单克隆，对测序成功的序列进行初步生物信息学分析。该文库为筛选辣椒-疫霉互作蛋白分子基因提供丰富资源，为研究辣椒-疫霉相互作用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取8～10叶期的卞椒1号辣椒无菌苗，接种疫霉菌孢子悬浮液（含游动孢子1 000个·mL-1）2 mL，分别于12、24、48、60、72 h后取样，液氮冻存，用于RNA提取。

Trizol试剂即TRIzon Reagent（CW0580），购自康为世纪，文库构建试剂盒Make Your Own“Mate & Plate”Library System User Manual（630490）购自Clonetech 公司。

1.2 文库的构建

1.2.1 高质量RNA的提取 采用Trizol法分别提取辣椒疫霉菌诱导的接种12、24、48、60、72 h后叶片的总RNA，具体方法参考说明书CW0580，利用琼脂糖凝胶电泳检测，同时用核酸蛋白测定仪检测总RNA的浓度及纯度。

1.2.2 cDNA的合成与纯化 以Total RNA为模板，参照说明书630490，以CDSIII/6 PCR Primer合成第一链，然后以3′PCR Primer和5′PCR Primer为引物通过LD-PCR合成双链cDNA。经CHROMA SPIN+TE-400（Clonetech）分离柱去除双链cDNA中200 bp以下短片段。

1.2.3 文库的构建 将质粒载体pGADT7-Rec与纯化后的双链cDNA连接，然后转入新鲜制备的酵母感受态Y187，涂布于100个SD/-Leu培养基平板，同时分别吸取1∶100、1∶1 000转化后的Y187细胞稀释液100 μL到SD/-Leu平板上，计算转化效率。4 d后用玻璃珠法，将收集下来的酵母溶于YPDA液体，混匀后与75%的甘油以2 V ∶1 V的比例混合保存于-80 ℃冰箱。

1.3 cDNA文库的检测

将酵母菌液10 μL稀释10 000倍后，取出50 μL涂布SD/-Leu平板，培养4 d，计算文库滴度。

文库滴度（cfu·mL-1）=平板上的克隆数/0.05 mL×10-4

库容量=文库滴度×悬浮体积（mL）

随机挑取50个单菌落，以pGADT7-Rec载体上的引物（参照说明书680490）进行PCR扩增，之后测序（上海生工生物工程有限公司），在辣椒数据库网站（http：//peppersequence.genomics.cn）对测序结果进行比对与分析。

2 结果与分析

2.1 AD-cDNA文库构建

2.1.1 RNA质量检测 提取高质量RNA是cDNA文库构建成功的关键，采用Trizol法分别提取辣椒疫霉菌诱导的卞椒1号叶片总RNA，经琼脂糖凝胶电泳检测可看出，提取的5个样品总RNA可见2条清晰的28S、18S RNA条带，完整性较好（图1）。经核酸蛋白仪测定（表1），5个样品的总RNA均符合文库构建的要求。将5个总RNA样品分别吸取1、0.6、0.5、0.6、0.8μL混匀，用于cDNA的合成。

图1 辣椒疫霉菌诱导的辣椒叶片总RNA凝胶电泳结果

表1 RNA质量检测

2.1.2 cDNA的合成 以CDSIII/6 PCR Primer引物合成cDNA，得到的双链cDNA带呈弥散状均匀分布（图2-a），质量完全符合建库要求。经CHROMA SPIN+TE-400树脂柱纯化后的双链cDNA带富集在400～3 000 bp（图2-b），经检测其质量和浓度均达到建库的要求。

2.2 AD-cDNA文库的质量鉴定

根据同源重组的原理，将合成的cDNA和pGADT7-Rec载体共转化酵母Y187感受态细胞，经过SD/-Leu平板筛选，4 d后获得阳性重组子（图3-a）。经统计，酵母转化液稀释1 000倍后涂布获得的重组子数目为24个单克隆（图3-b），文库的转化效率为4.8×106cfu·μg-1，高于建库要求。文库容量 = 24（每皿平均克隆数）/100 μL× 1 000×15×103μL = 3.6×106cfu。取转化后的酵母菌原液通过血球计数板计数，所得文库的酵母细胞浓度为2×108cfu·mL-1，达到酵母双杂交所需要的细胞浓度。

图2 dsDNA电泳结果

图3 文库构建与质量评估

用玻璃珠法收集文库克隆，取收集的文库菌液稀释10 000倍后涂布培养，观察计数（图4），计算文库滴度=286 cfu/0.05 mL×10-4=5.72×107cfu·mL-1。

图4 稀释平板计数文库滴度

随机挑取50个酵母菌落进行PCR检测，检查文库的空载率以及插入片段的平均长度。其结果表明，有6个单克隆未出现条带，文库质粒的空载率12%左右，重组率88%，插入片段长度为300～2 000 bp，平均长度约为800 bp（图5）。

图5 文库随机菌落PCR电泳检测

测序结果经Blast和DNAMAN多重序列比对，共有20个无重复序列，在辣椒数据库网站上进行序列比对，共有20组基因，编码17种已知蛋白，3种未知蛋白（表2）。

表2 文库克隆测序基因

3 结论与讨论

SMART技术构建文库操作简单，且获得全长比例较高。该技术避免了mRNA在分离纯化时发生降解和丢失；利用同源重组把外源双链cDNA定向重组到载体上，解决了连接效率低等问题，保证了cDNA文库的方向性和完整性（Zhu et al.，2001）。

辣椒基因组测序已经完成，研究人员构建了高密度的连锁图谱，并组装得到高质量的基因组精细图谱，基因组大小约为3.3 Gb，其中约90%的基因都锚定在染色体上（Qin et al.，2014）。本试验所构建的辣椒疫霉菌诱导的辣椒叶片全长cDNA文库转化效率约为4.8×106cfu·μg-1，文库滴度为5.72×107cfu·ml-1，重组率近90%，插入片段集中在300～2 000 bp之间，平均长度约为800 bp，达到了文库构建要求，还满足蛋白互作实验（酵母双杂交）。通过构建诱饵基因载体，可以在较短时间内从AD-cDNA文库中筛选出与诱饵基因互作的基因。

cDNA文库的重组率、滴度、插入片段的大小及片段完整性是检测文库的重要指标。总RNA质量直接决定cDNA文库质量的好坏，本文库构建中选取了条带清晰，无酚类、蛋白、多糖等污染的RNA样品，符合构建高质量cDNA文库的条件。利用多样品混合的文库来筛选和挖掘诱导相关基因，可为培育高产、优质和抗病的新品种辣椒提供丰富的基因资源，为辣椒新品种分子育种奠定基础。

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Construction of AD-cDNA Library for Interaction of Phytophthora capsici and Pepper in SMART Technology

ZHOU Zhi-guo，MING Yue-mei
（Life Science Department，Langfang City Normal College，Langfang 065000，Hebei，China）

In order to identify the Phytophthora capsici stress induced genes of pepper， a double-hybrid cDNA library of Phytophthora capsici infected pepper leaves was constructed using SMART technology. The results showed that the cDNA library contained 3.6×106independent clones， and the recombination rate was 88%. Insert fragments ranged from 300 bp to 2 000 bp， and the average length of the library was about 800 bp. These data demonstrate that the library is qualified， and able to provide important genetic resources for molecular breeding.

Phytophthora capsici；SMART technology；Double-hybrid cDNA library

周志国，男，讲师，主要从事蔬菜作物遗传育种工作，E-mail：zhiguo_zhou@163.com

2015-06-19；接受日期：2015-07-30

河北省科技计划项目（12226306），河北省高校食药用菌应用技术研发中心项目（YF201411）