胡萝卜品种资源遗传多样性及亲缘关系研究

马振国 欧承刚 刘莉洁 赵志伟 庄飞云

（农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室，中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

胡萝卜品种资源遗传多样性及亲缘关系研究

马振国 欧承刚 刘莉洁 赵志伟 庄飞云*

（农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室，中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

结合表型和SSR标记对29份中国胡萝卜地方资源、40份橘色栽培品种以及1份土耳其紫色品种进行遗传多样性和亲缘关系研究。田间农艺性状多样性分析表明，除叶长、根长、根粗外，春秋两季胡萝卜橘色栽培品种的多样性指数平均值低于地方资源。主成分分析结果表明，中国橘色地方资源和橘色栽培品种表型在秋季较为相似，但在春季差异较大。利用38对SSR引物对胡萝卜品种进行扩增，共扩增出133个多态性位点，其中中国地方资源与橘色栽培品种的平均多态性位点数分别为4.2和2.9个。中国地方资源的多态性信息含量值（0.74±0.06）明显高于橘色栽培品种（0.42±0.03）。聚类分析将供试胡萝卜材料分为2组，第I组包括所有橘色栽培品种和橘色地方资源B0241，第Ⅱ组包含其他地方资源和紫色品种L1。

胡萝卜；表型；SSR；聚类分析；遗传多样性；亲缘关系

胡萝卜（Daucus carota L.）是伞形科中种植最广泛的蔬菜作物，含有丰富的α和β胡萝卜素。但我国一些胡萝卜种植基地黑腐病、黑斑病、软腐病及根结线虫等病虫害发生日趋严重（欧承刚 等，2009），同时国内冬春大棚栽培、早春露地栽培规模不断扩大，先期抽薹现象也极为严重，因此挖掘胡萝卜抗逆资源、培育优良品种越发重要，但我国关于胡萝卜资源的遗传多样性报道较少（庄飞云等，2006），对胡萝卜病虫害及抗性资源筛选研究也非常薄弱。国外对于这些研究极为重视，有研究表明，Brasilia品种对黑斑病及根结线虫具有一定的抗性（Boiteux et al.，1993；Vieira et al.，2003）。现有研究发现中国也存在抗根结线虫品种资源，而且基因位点不同于Brasilia（Ali et al.，2013）。

普遍认为，栽培胡萝卜起源于10世纪前亚洲中部阿富汗等周边地区，最早驯化的胡萝卜类型为紫色、黄色和红色，13世纪传播到中国。中国关于胡萝卜最早的记载出现在王继先《绍兴校定经史证类备急本草》（1159年），该书记载胡萝卜已作为常用蔬菜，而且广泛用于生产，说明栽培胡萝卜在12世纪以前就已出现在中国，这与国外学者提出的观点不同，但没有提及根色。而在李时珍《本草纲目》（1578年）中提到了黄色和红色两种。最新研究表明，中国胡萝卜地方资源与阿富汗等周边地区资源亲缘关系较近，但这些报道只提及中国少量资 源（Iorizzo et al.，2013；Grzebelus et al.，2014；Rong et al.，2014）。橘色胡萝卜是全世界最主要的种植类型，是类胡萝卜素积累形成的胡萝卜演化历史的一个重要（Iorizzo et al.，2013），最早记载橘色栽培胡萝卜的历史文献出现于15、16世纪（Banga，1957；Stolarczyk & Janick，2011）。Banga（1957）认为橘色胡萝卜是从黄色胡萝卜中选育得到的，而Heywood（1983）认为橘色胡萝卜是由欧洲栽培种和野生种杂交形成的。目前大多认为中国橘色胡萝卜品种是由19世纪末引入的日本橘色品种逐渐演化形成的，但至今没有直接证据。

我国收集保存了389份胡萝卜地方品种资源，遍布29个省、市和自治区，包括黄色、红色、紫红色和橘色等不同类型资源（朱德蔚 等，2008）。本试验筛选了有代表性的中国地方资源以及国内外引进推广的橘色栽培品种，通过田间农艺性状鉴定和SSR标记分析中国地方品种资源与橘色栽培品种之间的亲缘关系，为研究中国胡萝卜的演化及抗性资源筛选奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

从中国农业科学院蔬菜花卉研究所国家蔬菜种质资源中期库筛选了29份中国胡萝卜地方资源，来源于19个省、市和自治区（庄飞云 等，2006）；筛选了40份国内外市场销售的胡萝卜橘色栽培品种，包括20份一代杂种（F1）和20份常规品种（open-pollinated），以及1份土耳其紫色地方品种（表1），均通过商业购买获得。2013年7月25日（2013-秋）、2014年3月10日（2014-春）分别在本所顺义基地进行露地播种，常规管理。

1.2 田间农艺性状调查及数据分析

田间农艺性状调查主要包括叶着生角度、叶面茸毛、叶型、叶色、叶基部花青素、根肩型、根肩绿色程度、根型、根尖型、根表皮颜色、根肉色、根心柱颜色、抽薹率、叶长、根长、根粗等16项。

叶长、根长和根粗为连续性变异，分别计算其平均值（X）和标准差（σ），进行10级分类，1级＜X-2σ，10级≥X+2σ，中间每级别差0.5σ（王述民等，2002），每个性状的多样性指数的计算公式为：H’=-Σ piln pi，其中H’为Shannon-Weaver多样性指数，pi为某性状第i级材料份数占总份数的百分比。其他13项农艺性状采用赋值后的数据进行统计分析，赋值依据胡萝卜种质资源描述规范和数据标准（庄飞云和朱德蔚，2007）。利用R3.1.1软件对春秋两季田间农艺性状进行主成分（principle component，PC）分析（Detlef et al.，2013），通过第一、第二主成分系数构建PC图。

表1 供试胡萝卜品种资源

1.3 SSR标记分析

每份试材随机选取6～10株植株幼嫩叶片混合取样，冷冻抽干，-80 ℃冰箱贮存。研碎后取约100 mg放入2 mL离心管，参照Doyle和Doyle（1987）改良的CTAB法提取DNA，工作液浓度稀释至30 ng·μL-1。参照Cavagnaro等（2011）发表的304对SSR引物，利用胡萝卜品种C3、C37、L1、B0214筛选出38对条带清晰、位点多态性明显的SSR引物。PCR反应体系为10 μL，包括2 μL （30 ng·μL-1）DNA，0.4 μL（2.5 mmol·L-1）dNTPs，上下游引物各0.25 μL（10 μmol·L-1），10×PCR Buffer（ 含 Mg2+）1 μL和 0.1 μL（2.5 U·μL-1）Tap酶，在MultiGene PCR仪中（Labnet，美国）进行扩增。反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性20 s，50～60 ℃退火 （参考不同引物）45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环后72 ℃延伸10 min。扩增产物4 ℃保存。6 %聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色。根据Cavagnaro等（2011）发表的引物扩增片段大小，统计电泳图谱上的条带，在同一位置出现的条带记为“1”，无条带记为“0”。

用PowerMarker V3.25软 件 进 行 UPGMA（unweighted pair-group method using arithmetic averages）聚类分析（Liu & Muse，2005）。遗传多态性分析采用多态性信息含量（polymorphism information content，PIC）指标，按照Anderson等（1993）的计算方法，标记i的PIC值计算公式为：PICi=1–ΣPij2，其中Pij表示标记i第j种带型出现的频率，本试验统计带型为“0”和“1”。PIC值范围为0～1，0表示无多态性，1表示具有多态性。

2 结果与分析

2.1 春秋两季胡萝卜田间农艺性状数据分析

在调查的13个田间农艺性状中（表2），2013年秋季橘色栽培品种叶色的多样性指数为1.09，高于地方资源的0.84，其余12个性状中，地方资源多样性指数均高于橘色栽培品种。2014年春季橘色栽培品种叶着生角度、叶面茸毛、叶型、根肩型、根型、根尖型的多样性指数高于地方资源。橘色栽培品种抽薹率春秋两季之间存在显著差异，秋季抽薹率多样性指数为0，而春季为0.53。综合比较两季13个性状的多样性指数平均值，地方资源均高于橘色栽培品种。

春秋两季之间橘色栽培品种和地方资源的叶长变异较大（表3），橘色栽培品种2013年秋季、2014年春季平均叶长分别为62.4 cm和52.5 cm，变幅分别为40.8～80.2 cm和33.2～73.0 cm，变异系数和多样性指数相似；地方资源2013年秋季、2014年春季的平均叶长分别为50.7 cm和70.0 cm，变幅分别为38.3～69.4 cm和50.2～91.0 cm，变异系数和多样性指数存在较大差异。橘色栽培品种和地方资源的根长和根粗在春秋两季之间差异不明显，但地方资源的根长和根粗变异系数要明显高于橘色栽培品种，而两者多样性指数则相似。

表2 橘色栽培品种和地方资源田间农艺性状多样性指数（H’）比较

表3 橘色栽培品种和地方资源数量性状比较

2.2 田间农艺性状主成分分析

通过田间农艺性状主成分分析，春秋两季材料分布存在明显差异（图1）。秋季前9个性状主成分累计方差贡献率为72.9%，第一主成分为根表皮颜色、根肉色，第二主成分为叶长，第三主成分为根心柱颜色。春季前7个性状主成分累计方差贡献率为76.6%，第一主成分为根心柱颜色、抽薹率，第二主成分为叶基部花青素，第三主成分为叶长、根粗（数据未列出）。秋季胡萝卜栽培橘色地方资源与橘色栽培品种重叠区域较多，即秋季两者表型相似品种较多，但橘色地方资源变异范围较大（图1-A）。春季橘色地方资源和橘色栽培品种表型特征差异较大，只有少部分重叠（图1-B），部分分布在其他根色资源品种之间。红色和黄色地方资源在春秋两季均形成自身分布区域，两者之间没有重叠。橘黄色品种B0089在两季均介于橘色和红色地方资源之间。紫色品种L1在两季均分布在外围。

图1 春秋季田间农艺性状主成分分析

2.3 SSR标记聚类分析

表4显示38对SSR引物共扩增出133个多态性位点，平均多态性位点3.5个。其中地方资源的多态性位点数（122个）与橘色栽培品种（116个）相当，但是地方资源平均多态性位点数（4.2）高于橘色栽培品种（2.9），特有位点数（12个）也多于橘色栽培品种（7个）。而且地方资源的多样性信息含量值（0.74±0.06）明显高于橘色栽培品种（0.42±0.03）。

聚类结果显示胡萝卜材料可分为2组（图2），第I组包括所有橘色栽培品种和中国橘色地方资源B0241，而第Ⅱ组包含其他地方资源和紫色品种L1。I组中又可分为2个亚组，Ⅰa由来自俄罗斯的C27、C31、C33、C34、C36、C38和C39，加拿大的C20和C21，荷兰的C24、C22和中国台湾的C15等组成；Ib主要包括国内育种公司引进推广的橘色栽培品种，包括日本、韩国的黑田类型，其中B0241、C10、C40、C29、C25分布在最外围。Ⅱ组也可分为2个亚组，Ⅱa包括中国大部分地方橘色资源、红色B0059、橘黄色B0089和紫色L1，Ⅱb由其他橘色、红色以及黄色中国地方资源组成，而且这些不同颜色资源呈相间分布。

表4 胡萝卜品种资源SSR位点多态性分析

图2 SSR标记聚类结果

3 结论与讨论

中国是胡萝卜种植面积最大的国家，近十年间生产面积3 不断结增论长与，我讨国论胡萝卜产业正处于数量快速增长向质量中发国展是的胡转萝型卜期种，植但面品积种最单大一的、国病家虫，害近泛滥、缺于少数适量应快现速有增栽长培向模质式量品发种展等的成转为型制期约，我但国品胡萝卜产种业等发成展为的制主约要我问国题胡，萝筛卜选产抗业逆发性展资的源主和要培问育优良品胡种萝是卜目发前展我的国首胡要萝任卜务发。本展试的验首通要过任对务。29本份试验通过间对农2艺9性份状中变国异地和方多资样源性和分40析份发橘现色，栽胡培萝品卜种春秋两方季资田源间差农异艺不性大状，变但异综和合多比样较性其分余析1发3个现性，胡萝卜橘种色，栽说培明品中种国叶地长方、资根源长表、型根多粗样多性样丰性富指。数通

与地方资源差异不大，但综合比较其余13 个性状，地方资源多样性指数平均值高于橘色栽培品种，说明中国地方资源表型多样性丰富。通过表型性状主成分分析，发现春秋两季橘色栽培品种分布集中，表型较为一致，遗传背景较为单一；而地方资源品种分布较分散，黄色、红色资源形成独立的区域，表型变异较大，并且我国橘色地方资源介于其他资源之间，表型变异较橘色栽培品种大。结合表型多样性指数分析结果，说明我国胡萝卜地方资源表型具有丰富的多样性。通过SSR 标记研究发现中国胡萝卜地方资源的多态性位点数、特有位点数以及多样性PIC值均高于橘色栽培品种，与表型鉴定结果一致，这为深入开展抗性资源筛选提供了依据。

通过聚类分析发现，市场上销售的所有橘色栽培品种聚到了第I组，包含加拿大丹佛斯类型品种C16和南特斯类型品种C17、C18、C19，俄罗斯阿姆斯特丹类型C37等常规品种，以及荷兰Bejo、韩国世农等育种公司推广的C1、C25、C40等杂交品种，说明国内外橘色胡萝卜栽培品种亲缘关系较近。Ⅱ组由橘色、红色以及黄色资源组成，而且在Ⅱb亚组这些不同颜色资源呈相间分布，说明中国橘色资源可能来自于本地红色或黄色资源的突变，这与Banga（1957）和Iorizzo等（2013）提出的橘色胡萝卜可能选自黄色栽培品种的观点较为相似。同时，土耳其地方品种L1与中国橘色地方资源聚到了一起，这与Rong等（2014）结果一致。综上所述，中国胡萝卜品种可能存在自身独特的驯化过程，其中橘色资源并不是从日本黑田类型演化形成的，实际上日本黑田类型品种是由欧洲引进的品种与亚洲资源杂交选育而成的（Simon et al.，2008）。

欧承刚，庄飞云，赵志伟，黄建新． 2009． 胡萝卜主要病害及抗病育种研究进展． 中国蔬菜，（4）：1-6．

王述民，曹永生，胡家蓬． 2002． 我国小豆种质资源形态多样性鉴定与分类研究． 作物学报，28 （6）：727-733．

朱德蔚，王德槟，李锡香． 2008． 中国作物及其野生近缘植物． 北京：中国农业出版社：93-114．

庄飞云，赵志伟，李锡香，胡鸿，方智远． 2006． 中国地方胡萝卜品种资源的核心样品构建． 园艺学报，33 （1）：46-51．

庄飞云，朱德蔚． 2007． 胡萝卜种质资源描述规范和数据标准．北京：中国农业出版社．

Ali A，William C M，Cavagnaro P F，Iorizzo M，Roberts P A，Simon P W. 2013. Inheritance and mapping of Mj-2，a new source of rootknot nematode （Meloidogyne javanica）resistance in carrot. Journal of Heredity，105 （2）：288-291.

Anderson J A，Churchill G A，Aurtique J E，Tanksley S D，Sorrells M E. 1993.Optimizing parental selection for genetic linkage maps. Genome，36 （1）：181-186.

Banga O. 1957. The development of the original European carrot material. Euphytica，6：64-76.

Boiteux L S， Vecchia P T D，Reifschneider F J B. 1993. Heritability estimate for resistance to Alternaria dauci in carrot. Plant Breeding，110：165-167.

Cavagnaro P F，Chung S M，Manin S，Yildiz M，Ali A，Alessandro M S，Iorizzo M，Senalik D A，Simon P W. 2011. Microsatellite isolation and marker development in carrot-genomic distribution，linkage mapping，genetic diversity analysis and marker transferability across Apiaceae. BMC Genomics，12：386-407.

Detlef G，Stefanie H，Sebastian K，Joachim S. 2013. Principal components analysis. Methods in Molecular Biology，930：527-547.

Doyle J J，Doyle J L. 1987. A rapid DNA isolation method for small quantities of fresh tissues. Phytochem Bull，19：11-15.

Grzebelus D，Iorizzo M，Senalik D，Ellison S，Cavagnaro P F，Alicja M P，Kasia H U ，Kilian A，Thomas N，Allender C，Simon P W，Rafal B. 2014. Diversity，genetic mapping，and signatures of domestication in the carrot（Daucus carota L.）genome，as revealed by Diversity Arrays Technology（DArT）markers. Molecular Breeding，33：625-637.

Heywood V H. 1983. Relationships and evolution in the Daucus carota complex. Israel Journal of Ecology and Evolution，32： 51-65.

Iorizzo M，Douglas A S，Shelby L E S，Grzebelus D，Cavagnaro P F，Allender C，Brunet J，Spooner D M，Allen D V，Simon P W. 2013. Genetic structure and domestication of carrot（Daucus carota subsp. stivus）（Apiaceae）. American Journal of Botany，100 （5）：930-938.

Liu K J，Muse S V. 2005. PowerMarker：an integrated analysis environment for genetic marker date. Bioinformatics，9：2121-2129.

Rong J，Lanmers Y，Strasburg J L，Schidlo N S，Ariyurek Y，de Jong T J，Klinkhamer P G，Smulders M J，Vrieling K. 2014. New insights into domestication of carrot from root transcriptome analyses. BMC Genomics，15：895-909.

Simon P W， Freeman R E， Vieira J V， Boiteux L S， Briard M， Nothnagel T， Michalik B， Kwon Y S. 2008. Carrot//Prohens J， Nuez F. Vegetables Ⅱ: Fabaceae， Liliaceae， Solanaceae， and Umbelliferae. Handbook of Plant Breeding Vol 2. New York：Springer：327-357.

Stolarczyk J，Janick J. 2011. Carrot：history and iconography. Chronica Horticulture，51：13-18.

Vieira J V，Charchar J M，AragÃo F A S，Boiteux L S. 2003. Heritability and gain from selection for field resistance against multiple root-knot nematode species（Meloidogyne incognita race 1 and M. javanica）in carrot. Euphytica，130：11-16.

Abstract：Genetic diversity and relationship between 29 Chinese carrot landraces，40 orange varieties and 1 Turkey purple cultivar were investigated using phenotypic and SSR markers. Phenotypic result showed that diversity index of orange varieties was lower than Chinese landraces except for leaf length，root length and root diameter. Principal component analysis showed that Chinese orange landraces had similar phenotypic variation with orange varieties in the autumn，but different in the spring. 133 polymorphic loci were amplified from 38 pairs of SSR primers. The average number of polymorphic loci of Chinese carrot landraces and orange varieties were 4.2 and 2.9，respectively. PIC value of Chinese carrot landraces（0.74±0.06）was obviously higher than that of orange varieties（0.42±0.03）. All accessions were divided into 2 groups: group I including orange varieties and orange B0241，and group Ⅱ containing other landraces and purple cultivar L1.

Studies on Genetic Diversity and Relationship of Carrot Varieties and Germplasm Resources

MA Zhen-guo，OU Cheng-gang，LIU Li-jie，ZHAO Zhi-wei，ZHUANG Fei-yun*
（Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops，Beijing 100081，China）

Carrot；Phenotype；SSR；Cluster analysis；Genetic diversity；Relationship

马振国，男，硕士研究生，专业方向：蔬菜遗传育种，E-mail：mazhenguo2015@163.com

*通讯作者（Corresponding author）：庄飞云，男，博士，副研究员，硕士生导师，专业方向：蔬菜遗传育种，E-mail：zhuangfeiyun@caas.cn

2015-04-15；接受日期：2015-06-01

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（2060302-2），国家科技支撑计划项目（2013BAD01B04），国家自然科学基金项目（31272162），中国农业科学院创新工程项目