杨木同步糖化发酵生产乳酸的条件优化

林丽云，王义强,b,c，马国辉，吴腾飞

（中南林业科技大学 a. 生物技术实验室；b. 经济林培育与保护教育部重点实验室；c. 国家林业局生物乙醇研究中心，湖南 长沙 410004)

杨木同步糖化发酵生产乳酸的条件优化

林丽云a，王义强a,b,c，马国辉a，吴腾飞a

（中南林业科技大学 a. 生物技术实验室；b. 经济林培育与保护教育部重点实验室；c. 国家林业局生物乙醇研究中心，湖南 长沙 410004)

以经过蒸汽爆破预处理后的杨木为原料，利用戊糖乳杆菌突变株进行同步糖化发酵。用高效液相色谱法测定发酵液中的乳酸含量，对酶解温度、酶解pH、纤维素酶添加量进行单因素试验分析，对发酵温度、发酵pH、接种量进行单因素试验分析，再通过正交试验对发酵条件进行优化。研究发现，最佳发酵条件：发酵温度为40℃，发酵pH为5.7，接种量为6%，纤维素酶添加量为15 FPU/g，乳酸产量为9.42 g/L，产酸量提高了83.62%。利用价格低廉且来源广泛的杨木发酵生产乳酸，具有广阔的工业应用前景。

杨木；同步糖化发酵；乳酸；优化

乳酸(lactic acid)是世界上公认的三大有机酸之一，目前已广泛应用于环保、食品、医药和化妆品等领域，尤其是聚合材料-聚乳酸，被认为是最有潜力的可生物降解高分子材料[1-2]，有望代替聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯等不可降解的塑料，消除“白色污染”，因此具有广阔的应用前景。

传统的乳酸发酵是以糖料、淀粉质等粮食作物为原料，不仅成本居高不下，而且消耗了大量粮食资源，从而限制了乳酸的应用。我国作为一个农业大国，木质纤维资源在国际上居于前列，科学地开发利用纤维资源是解决能源与粮食问题的主要途径之一[3-5]，如果能够利用木质纤维原料来生产利用价值较高的乳酸，可以缓解许多发酵部门的高成本原料问题，对生态环境的保护和可持续发展也具有积极的意义。

近年来国内外学者越来越热衷于利用纤维原料生产乳酸的研究。如徐忠等[6]筛选出1株性能优良的干酪乳秆菌，在发酵温度30℃，接种量10%，pH值5.5的条件下，同步糖化发酵大豆秸秆酶解物42 h，乳酸的产率达到80%。Thomas[7]以制浆造纸废料中的纤维素为原料，德氏乳杆菌NRRL B445发酵产乳酸，对糖转化率93%，副产物乙酸。乔长晟等[8]利用米根霉同步糖化发酵玉米芯，在温度34℃下发酵72 h后，还原糖残留量为4.55 g/L，纤维素的转化率为58.70%。

本文以经过蒸汽爆破预处理后的杨木为原料，利用戊糖乳杆菌突变株进行同步糖化发酵生产乳酸[9]。考察发酵温度、发酵pH、接种量对结果的影响，并用正交试验对发酵条件进行优化。

1 材料与方法

1.1 菌种

戊糖乳杆菌Lactobacillus pentosusC02，由中南林业科技大学生命科学与技术学院生物技术实验室诱变筛选并保存。

1.2 试验主要仪器设备

101-1AB型电鼓风干燥箱、HVE-50型高压灭菌锅、W-CJ-ID型超净工作台、722型分光光度计、安捷伦1100型液相色谱仪、KITMAN-T24型离心机、三角瓶（500 mL，250 mL）、培养皿（9 cm）。

1.3 培养基

种子培养基：眎蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、牛肉膏10 g/L、葡萄糖20 g/L、山梨醇酐单油酸1 g/L、柠檬酸铵2 g/L、MnSO4·H2O 0.05 g/L、3水合乙酸钠7.727 g/L、12水合磷酸氢二钠5.042 g/L、固体培养基添加琼脂20 g/L，调pH6.5。

产酸基础培养基：杨木爆破渣50 g/L，酵母浸粉 5 g/L，眎蛋白胨 10 g/L，Na2HPO4·12H2O.5 g/L，MgSO40.2 g/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，CaCO330 g/L。

1.4 还原糖标准曲线的测定

还原糖的测定采用DNS法[10]。

准确称取于103±2℃下烘干至恒重的无水葡萄糖1 g，精确至0.1 mg，用水溶解并定容至100 mL，分别吸取 0.00、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.5 mL于10 mL容量瓶中，用超纯水定容到10 mL，再分别吸取0.50ml葡萄糖标准液，加入3.0 mL DNS试剂和1.5ml缓冲液，用超纯水定容到25 mL，摇匀。每组三个平行，沸水浴10 min。于540 nm处测吸光度A，根据结果绘制标准曲线。

其回归方程为：

C=0.4641A－ 0.0243，R2=0.999 1。

1.5 酶解后还原糖含量的测定

准确称取杨木酶解液0.50 mL，按照1.4的方法测其吸光度，根据标准曲线计算还原糖含量。取3次平均值作为测量结果。

1.6 乳酸标准曲线的测定

精密称取准确称取乳酸1 g标准品放入10 mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容至10 mL，配成乳酸标准液，然后进行稀释，分别配成0.5 g/L，1 g/L，2 g/L，4 g/L，5 g/L的标准溶液。用0.45μm孔径的合成纤维素酯膜过滤。再分别经液相色谱检测，以浓度C为横坐标，峰高值A为纵坐标，绘制标准曲线。

其回归方程为：

A=145.69X＋8.715，R2=0.999 9。

1.7 发酵后乳酸含量的测定

将发酵后的发酵液先经两层纱布过滤，除去固形物，取5 mL滤液，（5 000 r/min，10 min）除去碳酸钙，加5 mL 0.01 mol/L的硫酸溶液进行酸解10 min，离心除去硫酸钙，经0.45 μm的滤膜过滤，取1 mL滤液适量稀释，高效液相色谱法测其峰高，根据标准曲线计算乳酸含量。取3次平均值作为测量结果。

2 结果与分析

2.1 温度对纤维素酶水解杨木效果的影响

温度过低，酶的活性不高，温度过高，容易引起酶的变性失活。以还原产量为考察指标，由图1可知，当温度较低时，酶活性很低，随着温度的升高，还原糖的产量也增大，在50℃时达到最高，50℃之后，随着温度的升高还原糖产量降低。因此选择的酶解温度为50℃。

图1 温度对还原糖产量的影响Fig.1 Effect of different temperature on production of reducing sugar

2.2 初始pH对酶解效果的影响

pH能改变蛋白质分子的电荷，从而影响酶的活性。以还原糖产量为考察指标，从图2可知，pH较低时严重抑制酶的活性，导致还原糖产量过低，当初始pH为5.5时，还原糖产量达到最大，初始pH超过5.5，还原糖产量降低。因此选择的酶解初始pH为5.5。

图2 初始pH对还原糖产量的影响Fig.2 Effect of initial pH on production of reducing sugar

2.3 纤维素酶添加量对酶解效果的影响

纤维素酶的投入量直接关系着还原糖产量，从图3可知，当酶添加量小于15 FPU/g时，随着酶添加量的增加，还原糖产量迅速增加，当纤维素酶添加量多于15 FPU/g时，还原糖产量增长不明显，综合价格因素，纤维素酶最佳添加量为15 FPU/g。

图3 纤维素酶添加量对酶解效果的影响Fig.3 Effect of the amount of cellulase on production of reducing sugar

2.4 温度对同步糖化发酵效果的影响

从图4可知，适当提高温度能够增加纤维素酶的酶解效率，为菌体生长代谢提供充足的还原糖，但是过高的温度导致菌体内一些酶发生变性失活，甚至能使菌体死亡。因此选择的较佳温度为40℃。

图4 温度对同步糖化发酵的影响Fig.4 Effect of temperature on SSF

2.5 初始pH对同步糖化发酵效果的影响

从图5可知，当初始pH为5.7时，乳酸产量达到最大，高于或低于这个值，乳酸产量都呈下降的趋势。pH较低有利于酶解的进行，但不利于发酵，pH较高时利于发酵但不利于酶解，因此选择的初始pH为5.7。

图5 初始pH对同步糖化发酵的影响Fig.5 Effect of initial pH on SSF

2.6 接种量对同步糖化发酵效果的影响

由于同步糖化发酵中，发酵的初始阶段发酵液还原糖含量少，接种量过大或过小都会影响发酵。从图6可知，接种量在6%之前，随着接种量的增加，乳酸产量也增加，在6%时达到最大，接种量超过6%，随着接种量的增加，乳酸产量反而降低。接种量较低时，菌体需要消耗更多的营养进行生长繁殖来增加菌体数目，从而导致代谢产物较少；当接种量过大时，菌体对发酵液的营养迅速吸收，造成酶解的还原糖供不应求，不利于代谢产物的累积，从而导致乳酸产量降低。因此选择的接种量为6%。

图6 接种量对同步糖化发酵的影响Fig.6 Effect of inoculums volume on SSF

2.7 同步糖化发酵条件的正交实验

在单因素试验的基础上，选取发酵温度、发酵pH、接种量和相应的水平值，采用L9(34)正交表设计实验，通过极差分析得出较优组合，再通过方差分析筛选出关键因素，从而确定同步糖化的最佳发酵条件，因素水平表见表1。正交试验方案及结果分析见表2，方差分析结果见表3。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and its levels of orthogonal experiment

表2 正交实验结果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 正交实验方差分析和显著性检验Table 3 Variance analysis and significant of orthogonal experiment

从表2可知发酵的最佳条件为A2B2C2，与正交试验结果直观分析得到的最优发酵条件一致，从表3可以看出F比：A＞B＞ C；即A、B和C三因素对乳酸产量的影响主次顺序为：温度＞初始pH＞接种量。由上述正交实验得出最佳的发酵条件组合为：温度45℃、初始pH 5.7、接种量为6%，优化后乳酸产量为9.42 g/L，相对优化前提高了83.62%。

3 结 论

利用戊糖乳杆菌突变株对杨木蒸汽爆破渣进行了同步糖化发酵，由正交试验确定的最佳发酵条件为温度45℃、初始pH 5.7、接种量为6%；优化后乳酸产量为9.42 g/L，相对优化前提高了83.62%。其中发酵温度对乳酸产量的影响最大，其次为初始pH。

[1]汪多仁. L-乳酸的开发与应用进展[J]. 化工中间体, 2004,(11)： 7-14.

[2]秀 平. 聚乳酸塑料研发热点[N]. 中国化工报, 2004.

[3]金士威, 朱圣东, 吴元欣, 等. 木质纤维原料酶水解研究进展生物质化学工程[J]. 2006, (5)： 48-53.

[4]Gao P J. Porgress in the mechanism of cellulose degradation and structure function studies of cellulases[J]. Progress in Natural Science, 2003, 13(l)： 21-29.

[5]张艳哲, 李 毅. 秸秆综合利用技术进展[J]. 纤维素科学与技术 , 2003, 11(2)： 58-60.

[6]徐 忠, 杨 萍, 赵兰天. 大豆秸秆酶解物发酵制备L-乳酸的研究[J]. 生物质化学学报, 2006, (5)： 9-13.

[7]Shigenobu Miura, Arimura T, Itoda N,et al. Production of L-Lactic Acid from Corncob[J]. Journal of bioscience and Bioengineering, 2004, 97(3)： 153-157.

[8]乔长晟, 汤凤霞. 利用纤维素类物质玉米芯生产L-乳酸的研究[J]. 中国食品学报, 2006, (8)： 101-105.

[9]钟 洁,王义强,华涟滩,等. 基于杨木纤维发酵产丁醇工艺条件的研究[J]. 中南林业科技大学学报,2015,35(7)：125-130.

[10]王天龙, 仇宏伟, 陈海华, 等. 3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定D-半乳糖醛酸含量的条件探索[J]. 安徽农业科学, 2008,36(16)： 6829-6832.

The optimization of SSF conditions for poplar woods to lactic acid

LIN Li-yuna, WANG Yi-qianga,b,c, MA Guo-huia, WU Teng-feia
(a. Biotechnology Laboratory; b. Key Lab of Non-wood Forest Nurturing and Protection of National Ministry of Education; c. Bio-ethanol Research Center of State Forestry Administration, Central South University of Forestry &Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

In this paper, poplar woods,which was pretreated by steam explosion,was used for SSF with mutant lactobacillus pentosus.The content of lactic acid was measured by HPLC，analysis on the enzymatic temperature,the enzymatic pH, the amount of cellulase separately,after analysis on the fermentation temperature,the fermentation PH,the inoculation amount，the fermentation conditions was optimized by orthogonal experiments. The results showed that the optimum fermentation conditions was as follows：the fermentation temperature was 40 ℃, the fermentation pH was 5.7, the inoculation amount was 6%, the amount of cellulase was 15 FPU/g and the yield of lactic acid was 9.42 g/L which raised 83.62% compared with the original conditions. Taking advantage of the cheap and extensive poplar woods for the production of lactic acid will have a broad prospect for industrial application.

poplar woods; SSF; lactic acid; optimization

S792.11

A

1673-923X(2015)10-0138-04

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.10.024

2014-02-10

国家林业局“948”项目“木质纤维生物炼制丁醇汽油及聚乳酸生物塑料技术引进”（2011-4-13）

林丽云, 硕士研究生

王义强，教授，博导；E-mail：wangyiqiang12@163.com

林丽云，王义强，马国辉，等. 杨木同步糖化发酵生产乳酸的条件优化[J].中南林业科技大学学报，2015,35(10)：138-141.

[本文编校：吴 彬]