大孔吸附树脂对葵仁多酚的分离富集

徐丹丹 张文斌，2 杨瑞金，2 赵 伟，2 华 霄，2（.江南大学食品学院，江苏 无锡 2422；2.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 2422）

葵花籽是重要的油料作物，其中含40%～60%的油脂和21%～31%的蛋白质［1］，此外还含有较为丰富的酚类物质，特别是绿原酸占总酚含量的70%以上［2］。绿原酸（chlorogenic acid，CGA）又名5－O－咖啡酰奎尼酸（5－O－CQA），是由奎尼酸和咖啡酸组成的缩酚酸，广泛存在于植物食品中，由于其羟基取代的高反应性和吞噬自由基的能力而有很好的抗氧化活性［3］。研究［4］发现，绿原酸等多酚类化合物具有延缓肿瘤发作、抑制肿瘤形成与低密度脂蛋白氧化及血小板凝集等功能，这些功能都与其抗氧化性能有关。此外，绿原酸还具有利胆、抗菌、降压、增高白血球和兴奋中枢神经系统等多种药理作用，是一种极具开发价值的潜在天然化合物［4，5］。

对于绿原酸类物质的分离富集，常用方法有沉淀法［6，7］、溶剂萃取法、超滤法［8，9］、大孔吸附树脂法［10，11］。前两者方法存在溶剂耗用量大、操作繁琐、材料不易再生等缺点，相比而言，超滤和大孔吸附树脂具有独特的优势。超滤膜分离技术具有操作简便、无污染、在常温下能连续操作等优点，特别适用于热敏性物质［12］。根据目标物的分子量大小选取合适的超滤膜，可将提取液中的多糖、蛋白、鞣质等一系列大分子物质去除，达到分离纯化目的。而大孔吸附树脂则以高效、经济等优势越来越广泛用于生物活性物质的分离纯化，这是由于大孔吸附树脂具有理想的孔径结构和较大的比表面积。大孔树脂根据化合物分子量、极性、分子形状等差异用于黄酮、皂苷、生物碱的分离纯化［13］，具有分离效果好，操作成本低、消耗溶剂少、容易再生等优点［14，15］。

目前，绿原酸主要从金银花和杜仲叶中提取，而葵花籽作为一种酚类丰富的植物原料，很少用于酚类提取。同时，葵仁中由于存在绿原酸等酚类，易在加工时与蛋白质发生反应，影响蛋白的色泽和功能性质，导致优质蛋白和多酚的双重浪费［16，17］。因此，本研究拟从葵仁中直接提取绿原酸类多酚，此粗提液经超滤初步纯化后再采用大孔吸附树脂进一步分离富集，以获取纯度较高的多酚类产品，实现葵仁资源的高附加值开发。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

脱壳葵仁：产自内蒙古河套地区，收获于2014年秋；

盐酸、乙醇：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

绿原酸：纯度≥95%，美国Sigma－Aldrich公司；

咖啡酸：纯度≥98%，美国Sigma－Aldrich公司；

大孔吸附树脂：AB－8、D101、HPD850、NKA－9、NKA－Ⅱ、XDA－4、XDA16HP、XDA－1B、XDA－1型，郑州勤实科技有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

紫外可见分光光度计：UV－1100型，上海美谱达仪器有限公司；

高效液相色谱仪（配L2455DAD检测器）：HITACHIL－2000型，日本日立公司；

超高效液相质谱仪：Waters Acquity UPLC型，美国Waters公司；

超级恒温循环槽：MP－501A型，上海一恒科技有限公司；

超滤系统膜套：PLBC－C型，美国Millipore公司；

全温培养摇床：QYC－2102型，上海新苗有限公司；

电脑全自动部分收集器：DBS－100型，上海沪西分析仪器厂有限公司；

电脑数显恒温泵：DHL－A型，上海沪西分析仪器厂有限公司；

实验室pH计：FE20型，梅特勒—托利多仪器有限公司；

离心机：LXJ－ⅡB型，上海安亭科学仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 绿原酸类多酚粗提液制备及初步纯化 取适量葵仁与0.001mol/L的盐酸溶液以料液比1∶5（m∶V），在90℃下搅拌提取1.0h后，用纱布分离葵仁与浸提液，待浸提液冷却后将其pH调至4.5，静置一段时间后离心（5 000r/min，10min），抽滤，经截留分子量为3kDa的再生纤维素膜避光超滤后，得到澄清透明的提取液，调节pH至3.0，避光备用。

1.2.2 绿原酸类多酚含量的测定

（1）紫外分光光度法测定绿原酸含量的标准曲线：取10mg绿原酸标品稀释定容至50mL的棕色容量瓶中，再取10mL定容至100mL，得20μg/mL的绿原酸溶液，分别稀释成2，6，10，14，18μg/mL，在327nm下用紫外分光光度计测定，绘制吸光值—浓度曲线方程为y＝48.874x－0.001（R2＝0.999 9）。

（2）高效液相法测定绿原酸含量的标准曲线：色谱条件：Agilent Zorbax SB－C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相为乙腈∶2%乙酸溶液＝15∶85（V∶V）；流速0.5mL/min；柱温25℃；检测波长327nm（DAD监测波长为190～400nm）；进样量10μL。

标准曲线的制作：精确称取50mg绿原酸标准样品，用甲醇溶解至浓度1mg/mL，并进一步稀释成0.75，1.5，3，15，75，150μg/mL。经0.22μm 微孔滤膜过滤后，进样至HPLC测定。按上述色谱条件，以峰面积为纵坐标，溶质浓度为横坐标，绘制绿原酸的标准曲线方程为y＝22 680.24x－9 820.20（R2＝0.999 8）。

（3）紫外分光光度法和高效液相色谱法测定多酚含量的相关性分析：将超滤处理后的多酚提取液稀释成5种不同浓度，分别采用高效液相色谱仪和紫外分光光度计测定，以液相测定浓度（mg/mL）为横坐标，紫外测定浓度（mg/mL）为纵坐标作相关性曲线，得到回归方程：y＝1.229 5x＋0.000 1（R2＝0.999 4）。

由于紫外分光光度法和高效液相色谱法在测定多酚含量时具有较高的相关性，考虑到简便，采用紫外分光光度法对多酚含量进行测定。

1.2.3 酸浸提液中产物种类的UPLC—MS/MS鉴定

（1）色谱条件：Waters Acquity BEH C18（2.1mm×100mm）色谱柱；流动相A为乙腈，B为0.1%甲酸，梯度洗脱：0～0.1min，2%A；0.1～8min，2% ～40%A；8～11min，40% ～100%A；11～12min，100%A。流 速0.3mL/min，检测波长 327nm，DAD 检测波长为 200～600nm，进样量1μL。

（2）质谱条件：美国 Waters质谱仪。电喷雾离子化（ESI）源，离子源温度为100℃，负离子检测，毛细管电压为3.0kV，锥孔气流量为50L/h，脱溶剂温度为400℃，脱溶剂气体流量为500L/h，扫描范围m/z为50～1 500。

1.2.4 大孔吸附树脂静态吸附及解吸

（1）树脂预处理及水分含量测定：采用95%（V/V）乙醇浸泡树脂24h，过滤，然后用去离子水洗涤至无醇味，布氏漏斗抽干待用。称取湿树脂各3g，精确到0.000 1g，并置于恒重过的水分盒中，于105℃下烘至恒重，计算树脂的水分含量。

（2）树脂的筛选：各称取树脂0.7g（湿基），装入250mL的锥形瓶中，加入多酚浓度为2.0mg/mL的提取液200mL，在25℃、120r/min条件下振荡吸附10h，吸附结束后测定残余溶液中多酚的浓度。将上述已吸附的树脂，用去离子水淋洗后，置于250mL锥形瓶，加入80%（V/V）的乙醇溶液200mL，在25℃、120r/min下恒温振荡解吸4h，测定解吸溶液中多酚的浓度。各树脂的吸附量、解析量以及解析率分别按式（1）～（3）计算：

式中：

Qe——吸附量，mg/g·干树脂；

C0、Ce——吸附前和吸附后溶液中的多酚浓度，mg/mL；

Vi——加入的多酚粗提液的体积，mL；

W——树脂的干重，g；

Qd——解吸量，mg/g·干树脂；

D——解吸率，%；

Cd——解吸液中多酚浓度，mg/mL；

Vd——解吸液体积，mL。

（3）吸附动力学曲线的绘制：称取筛选后的湿树脂0.7g置于250mL锥形瓶中，加入200mL、2.0mg/mL的多酚提取液，在25℃、120r/min条件下恒温振荡吸附，并每隔20min取样测定残余多酚含量，直至吸附达到平衡，绘制吸附动力学曲线。

（4）吸附初始pH的挑选：用0.1mol/L的盐酸溶液将提取液的初始pH 分别调节至2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，计算吸附后残余溶液中多酚的浓度。并绘制以吸附量为纵坐标，pH为横坐标的曲线。

（5）吸附等温线的绘制：分别称取0.7g湿树脂于250mL锥形瓶中，加入200mL不同浓度（0.7～3.6mg/mL）的提取液，于25℃下以120r/min振摇吸附10h，测定吸附后残液的多酚浓度。

1.2.5 大孔吸附树脂动态吸附及解吸

（1）泄露曲线的绘制：称取约18g湿树脂装于Φ1.0×30cm的层析柱中，其中树脂的床体积（BV）为26mL，将浓度为2.0mL/L、pH 3.0的多酚提取液分别以2BV/h和4BV/h的流速进样，5mL/管收集流出液并测定多酚浓度，直至流出液与上样液的多酚浓度相等，此时树脂已完全达到吸附饱和，停止进样。绘制泄露曲线。

（2）梯度洗脱：将浓度为2.0mL/L、pH 3.0的多酚提取液以2BV/h的流速上样30BV，用去离子水以2BV/h的流速洗去水溶性成分和树脂间未吸附的多酚，再依次用10%，30%，50%，70%，90%（V/V）的乙醇溶液以4BV/h的流速洗脱7BV，测定各洗脱液的多酚浓度及纯度。

（3）动态洗脱曲线的绘制：将浓度为2.0mg/mL、pH 3.0的多酚提取液以2BV/h的流速上样30BV，经水洗后，先用10%（V/V）乙醇洗脱7BV，然后用50%（V/V）乙醇分别以1BV/h和4BV/h的流速洗脱收集，并经适当稀释后测定多酚浓度，绘制洗脱曲线。

（4）产物纯度的测定：将洗脱液于55℃下真空旋转蒸发至30mL左右，置于培养皿，并用去离子水清洗残余壁上的液体，合并后冷冻干燥。绿原酸类物质的纯度定义为洗脱液中绿原酸类质量与干燥后总物质质量的比值。

1.3 数据处理

试验得到的数据用SPSS 17.0统计软件进行方差分析。用LSD检验判别数据之间的差异性，显著差异水平P＜0.05。重复试验3次，所得数据以均值±标准差表示。

2 结果与讨论

2.1 提取液成分的UPLC—MS/MS分析

由图1可知，提取液中主要含4种化合物。经质谱（UPLC—MS/MS）进一步检测分析（见图2），酸液产物主要为绿原酸 （5－O－CQA）、新 绿 原 酸 （3－O－CQA）、隐 绿 原 酸 （4－OCQA）和未知化合物 X，其中5－O－CQA含量居多［18－21］。Nakatani等［22］研究表明3－O－CQA、4－O－CQA 和5－O－CQA具有相同的抗氧化能力。Kan等［23］也表明这3种物质在消除自由基和对抗癌细胞毒素能力方面几乎没差别。因此，绿原酸的异构化并不影响总酚的生物活性，将这3种物质一并进行富集回收。

图1 葵仁90℃下酸浸提液的UPLC洗脱曲线Figure 1 UPLC elution curve of acid solution extract from intact sunflower kernel at 90℃

2.2 多酚粗提液的超滤纯化

经浸提后，葵仁多酚粗提液的纯度只有4%，且体系极不稳定，在低温（4℃）下静止1～2d便会有杂质的絮凝且变质。经截留分子量为3kDa的超滤膜初步纯化后，多酚透过率达99%以上，蛋白截留为62%，粗提液纯度达15%。虽然大部分的蛋白质可经超滤截留，但是残余的蛋白质或多肽等杂质与多酚组成的体系仍不稳定，若要获得多酚这类高生物活性的物质，考虑可采用大孔吸附树脂进一步纯化。

2.3 大孔树脂静态吸附及解吸条件的确定

2.3.1 树脂的水分含量 测定了大孔吸附树脂的水分含量，见表1。

图2 UPLC洗脱峰的二级质谱图Figure 2 MS/MS spectra of UPLC eluted peaks

表1 各树脂的性能参数Table 1 Properties of the tested macroporous resins

2.3.2 大孔吸附树脂的吸附量、解吸量和解吸率 由图3可知，除了HPD850和XAD16HP外，其余7种树脂对多酚都具有较高的吸附性能，特别是XDA－1、XDA－1B和NKA－Ⅱ树脂对绿原酸类的吸附能力尤为显著。至于解吸性能，这些树脂都表现出良好的解吸能力，且解吸率都在80%以上。

图3 葵仁多酚在9种不同树脂上的吸附量、解吸量和解吸率Figure 3 Adsorption and desorption capacities，and desorption ratio of sunflower kernel polyphenols on different resins

绿原酸及其两种异构体都含有羧基和5个羟基，为极性化合物。根据“相似相溶”原则，一般来说，极性化合物在极性树脂上具有较好的吸附能力。虽然HPD850和NKA－Ⅱ同为极性树脂，但是绿原酸类在这两种树脂上的吸附差异较大，分别为37.66，207.66mg/g。可见，极性并非是唯一的决定因素，树脂的其他一些物理特性，如比表面积和平均孔径都会影响绿原酸类物质的吸附效果，如XDA－4和XDA16HP同为非极性树脂且比表面积相近，但是XDA－4的吸附量（93.07mg/g）要远远高于 XDA16HP（57.73mg/g），可能是由于平均孔径的不同造成吸附能力的差异。事实上，除了以上这些树脂的物理特性（极性、比表面积和平均孔径），树脂的化学成分和结构同样也严重影响着吸附性能，如AB－8和XDA－1B具有类似的极性、比表面积和平均孔径，但在吸附效果上却有显著差异。

在上述所选的非极性树脂中，XDA－1具有非常大的比表面积，而XDA－1B树脂带有弱极性基团的吸附剂，是XDA－1树脂的补充和改进，虽然比表面积小于XDA－1，但由于树脂内部孔表面带有弱极性基团，对水溶性差、从水相扩散到树脂相阻力较大的有机物吸附速度快，吸附量大。此外，NKA－Ⅱ也表现出良好的吸附能力。综合考虑，XDA－1、XDA－1B和NKA－Ⅱ更适合多酚的分离和纯化，因此对于这3种树脂将通过动态吸附试验进行进一步筛选。

2.3.3 树脂的吸附动力学曲线 由图4可知，绿原酸类物质在3种树脂上不仅有较高的吸附能力，还具有较好的吸附速率。在前100min内3种树脂的吸附量迅速增加，到120min后基本趋于稳定，达到吸附平衡。XDA－1和XDA－1B比NKA－Ⅱ具有更高的吸附容量，同时XDA－1和XDA－1B二者的吸附容量和吸附速率不相上下，考虑到解吸量，最终选定XDA－1树脂进行后续试验。

图4 葵仁多酚在3种树脂上的吸附动力学Figure 4 Adsorption kinetics of sunflower kernel polyphenols on three different resins

2.3.4 初始pH对吸附量的影响 初始pH值对吸附量的影响相当明显（见图5）。pH值不仅改变了绿原酸及类似物在溶液中的状态，同时也影响溶液流经树脂时目标物在树脂表面吸附能力的强弱。Sun等［24］研究5－O－CQA在极性树脂ADS－21上的吸附行为时发现：当pH值为2时，绿原酸在树脂上的吸附能力最大，随着pH值增大，吸附能力逐渐下降。这是因为pH值决定了绿原酸分子的电离程度，由此影响吸附性能，且在极性树脂吸附过程中，氢键可能起到非常重要的作用，若在高pH值下，酚羟基电离形成H＋和相应的阴离子，导致5－O－CQA和大孔吸附树脂之间氢键作用减少。而本试验所使用的XDA－1树脂为非极性树脂。由图5可知，随着pH增大，特别是当pH＞3时，绿原酸类的吸附能力明显下降，这可能是因为在较低pH值下，绿原酸类物质是以分子状态的形式存在于溶液中，易被树脂吸附；当在较高pH溶液中，绿原酸类以离子状态存在且难被树脂吸附［25，26］。因此，较佳的吸附条件为pH≤3，考虑到pH 2和pH 3下，XDA－1对目标物的吸附能力相差不大（吸附量分别为432.48，424.41mg/g），因此将上样溶液的pH值调节至3。

2.3.5 吸附等温线 为了进一步揭示多酚在XDA－1树脂上的吸附规律，分别采用Langmiur和Freundlich方程进行拟合。Langmiur方程描述的是较理想的单分子吸附，其模型通常表述为：

图5 不同初始pH下葵仁多酚的吸附量Figure 5 Adsorption capacities of sunflower kernel polyphenols under different initial pH

式中：

Qe——吸附量，mg/g·干树脂；

Ce——吸附后溶液中的总酚浓度，mg/mL；

Q0——经验常数，与树脂的吸附能有关；

K——吸附平衡常数，与最大吸附量有关。

而Freundlich方程适用于非理想的不均匀吸附，其模型表述为：

式中：

Qe——吸附量，mg/g·干树脂；

Ce——吸附后溶液中的总酚浓度，mg/mL；

K——Freundlich常数，反映树脂吸附能力大小；

1/n——经验常数，表明树脂的吸附强度。

由图6可知，随着初始浓度的增加，吸附量也随之增加。从相关性程度（R2）来看，Langmiur方程（R2＝0.996 9）的相关性比Freundlich方程（R2＝0.986 9）的要高，说明Langmiur方程更加适合描述绿原酸类在XDA－1树脂表面的吸附行为，同时表明绿原酸类在XDA－1树脂表面的吸附是单分子层吸附。通常当1/n＜0.5时，表明吸附很容易发生；当0.5＜1/n＜1时，吸附发生较难；当1/n＞1时，吸附几乎不可能发生［27］。由表2可知，Langmiur方程中1/n＝0.402 2，说明XDA－1树脂比较适合绿原酸类的吸附。

2.4 大孔树脂动态吸附及解吸条件的确定

2.4.1 上样流速及上样体积 树脂对目标物的吸附能力并非是持续不变的，当树脂吸附到达一定量时，树脂对目标物的吸附作用会降低，进样液便从树脂柱上泄露。因此，确定上样流速和上样体积是非常必要的。一般而言，泄漏点是树脂对目标物吸附能力突变的点，其范围定义为流出液的浓度达到上样液溶度的1%～10%。为了确定XDA－1树脂对绿原酸类溶液吸附较佳的上样流速和上样体积，分别采用2BV/h和4BV/h的速度进行上样，其泄露曲线见图7。通过曲线分析，当流出液的浓度达到上样液溶度的5%后，流出液中目标物的浓度急剧增大，说明此后XDA－1树脂对目标物的吸附能力显著降低，所以将Ct/C0＝5%定义为泄漏点，此点对应的上样体积称之为泄漏体积。当上样流速定为4BV/h和2BV/h时，泄漏体积分别为20BV和30BV。假如将上样流速降低到1BV/h，可能会使泄露体积增大，但是同时也大大增加了上样的时间。因此在后续试验中将上样流速定为2BV/h，上样体积定为30BV。

表2 葵仁多酚在XDA－1树脂上的Langmiur和Freundlich的拟合方程Table 2 Langmiur and Freundlich equations for polyphenol adsorption isotherms on XDA－1resin

图6 葵仁吸附等温线的拟合Langmiur和Freundlich方程Figure 6 Fitting of adsorption isotherms with Langmiur equation and Freundlich equation

图7 动态吸附条件下不同上样流速时的泄露曲线Figure 7 The breakthrough curve at different flow rate under dynamic adsorption condition

表3 不同上样流速下多酚在XDA－1树脂上的泄露体积和吸附量Table 3 Breakthrough volume and capacity of polyphenols absorbed on XDA－1resin at different flow rate

2.4.2 梯度洗脱及组分纯度 上样结束后依次经不同浓度的乙醇梯度洗脱，其产物的洗脱比例和纯度见图8。虽然10%（V/V）乙醇能洗脱下13.7%的多酚类物质，但纯度只有57%。大部分目标物质可以在30%（V/V）和50%（V/V）乙醇浓度下洗脱下来（洗脱比例分别为48.4%和33.5%），且纯度都达到70%以上。70%（V/V）乙醇洗脱下2.2%的目标物，纯度为47%，而90%（V/V）乙醇只洗脱下0.1%，纯度只有9%。假如要获得较高纯度的多酚类物质，可先采用10%（V/V）乙醇洗脱除去纯度较低的目标物，然后再用50%（V/V）乙醇洗脱收集。

图8 葵仁多酚在XDA－1树脂柱上的梯度洗脱Figure 8 Gradient elution of sunflower kernel polyphenols on XDA－1resin column

图9 葵仁多酚在XDA－1树脂柱上的动态解吸曲线Figure 9 Dynamic desorption curve of sunflower kernel polyphenols on XDA－1resin column

2.4.3 树脂动态解吸曲线 采用10%（V/V）乙醇洗脱除去纯度较低的多酚，再用50%（V/V）乙醇进行洗脱收集，其洗脱曲线见图9。采用4BV/h的流速进行洗脱时，2h后基本洗脱完全，若将流速改为1BV/h，需要5h才能洗脱完全，大大延长了洗脱时间，不适于工业化生产，因此采用4BV/h的流速进行洗脱。经大孔吸附树脂富集纯化后，产物的回收率为82.3%，纯度可由原来的15%提高到77%。

3 结论

将酸液用于葵仁多酚的提取，可获取以绿原酸为主的大部分多酚，将此粗提液依次经超滤和大孔树脂吸附解吸可实现富集纯化。结果表明：经截留分子量为3kDa的超滤膜处理后，多酚透过率为99%，纯度由4%提高到15%；超滤后的提取液经大孔吸附树脂进一步富集，其优化工艺条件为多酚浓度2.0mg/mL、pH 3.0、上样速度2BV/h、上样体积30BV，此时吸附达到泄漏点；吸附结束后，先采用10%（V/V）的乙醇进行部分去杂，然后用50%（V/V）乙醇以4BV/h的速度进行洗脱收集，产品纯度可由15%提高到77%，回收率为82.3%。超滤和大孔吸附树脂联合可适用于葵仁多酚的富集回收。

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