杜香多糖的抗氧化活性及物理性质研究

张乔会 王建中 逄锦慧 崔 洁 杨 喆 罗兴武

（1.湖北民族学院科技学院，湖北 恩施 445000；2.北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083；3.林业食品加工与安全北京市重点实验室，北京 100083）

杜香（Ledum palustreL.）为杜鹃花科杜香属的常绿灌木［1］，是中国东北、内蒙古大兴安岭林区的主要组成树种，其分布面积约占大兴安岭林地面积的70%［2］。据统计［3］，大兴安岭杜香干叶年产量达53.6万t。杜香枝叶成分丰富，含有多种挥发性精油、熊果酸、多糖等［4，5］。

杜香资源丰富，目前主要研究其精油［6］、熊果酸［7］等，而对杜香多糖的理化性质研究未见报道。随着保健品市场的活跃，杜香资源开发潜力巨大，研究杜香多糖的抗氧化性、稳定性、分子刚性等对于杜香的综合开发利用具有重要意义。本研究拟通过水提醇沉法提取杜香多糖［8］，利用红外分析鉴定多糖基团，利用蒽酮硫酸法［9］测定杜香多糖粗物中多糖的含量，通过总还原力测定［10－12］和分别清除羟基自由基［13－16］、DPPH自由基［17－19］、超氧阴离子［20－22］能力4种 评价方法，分析杜香多糖的抗氧化活性。并采用一般材料分析方法分析杜香多糖的物理性质，为其开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

杜香：由内蒙古金河林业局提供，经北京林业大学植物专家鉴定，自然风干后磨粉并过40目筛，放干燥器中备用；

1，1－二 苯 基－2－苦 肼 基 （1，1－dipheny1－2－picrylhydrazyl，DPPH）、邻苯三酚、硫酸亚铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、VC、铁氰化钾、三氯乙酸、2，6－二叔丁基－4－甲基苯酚（BHT）、三氯化铁、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、氢氧化钠、邻菲罗啉：分析纯，北京化工厂。

1.2 试验仪器

FT－IR红外光谱仪：Tensor27型，德国Bruker公司；

热重分析仪：TGA60型，日本Shimadzu公司；

旋转蒸发仪：RE－5203型，上海亚荣生化仪器厂；

电子天平：METTLER TOLEDO型，梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司；

X射线衍射仪：XRD－6000型，日本Shimadzu公司；

冻干机：LL1500型，美国Thermo Fisher Scientific公司；

分光光度计：普析T6型，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 试验方法

1.3.1 杜香多糖的提取 采用水提醇沉法：准确称取一定量的杜香枝叶粉，按1∶35（m∶V）加入去离子水，然后放入恒温水浴震荡箱中80℃震荡6h，离心分离液体和固体粉末，向上清液中加入酒精至浓度为85%，置于4℃冰箱中静置1h，然后分离固液两相，固体为粗多糖。

1.3.2 杜香多糖纯化 将1.3.1得到的样品按1∶10（m∶V）加入石油醚处理5h进行脱脂，接着将脱脂样品按1∶2（m∶V）溶解于去离子水中，加入酒精至浓度为85%，置于4℃冰箱中静置1h，分离固液两相，重复上述操作4次，然后采用Sevag法［23］脱蛋白，所得样品在－110℃下冷冻干燥，便可得到杜香多糖成品。将脱脂脱蛋白和脱脂未脱蛋白的多糖样品配成100μg/mL的溶液，利用紫外光谱分析脱脂、脱蛋白前后杜香多糖的变化。

1.3.3 杜香多糖的红外分析 取少量样品置于红外光谱仪中进行测定，扫描分辨率2cm－1，扫描范围为400～4 000cm－1，扫描次数32次［24］。

1.3.4 杜香多糖含量测定 采用蒽酮硫酸法［23］，并以葡萄糖为参照制作标准曲线。

1.3.6 杜香多糖的TG分析 准确称取3～8mg的杜香多糖，放入综合热重分析仪内进行热综合（TG）分析测定，以考察杜香多糖的热稳定性。分析条件：扫描温度20～600℃，升温速度10℃/min，N2流速40mL/min［24］。

1.3.7 杜香多糖的X－RD分析 取一定量的杜香多糖于X射线衍射仪的样品室内进行扫描，扫描范围为5°～60°，在扫描范围内以5°/min的变化速率进行X射线照射，利用得到的数据绘制XRD衍射强度曲线图，并计算出样品的结晶度。根据衍射角与衍射强度的关系绘制XRD曲线。

1.4 数据分析

采用 Microsoft Excel（Office 2007）软件整理数据，Orgin软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 杜香多糖纯化结果分析

由图1可知：未脱蛋白前，杜香多糖溶液在280nm处有明显的吸收峰，说明其含有蛋白成分。脱蛋白后的样品在280nm处没有明显的吸收峰，说明其不含蛋白。与未脱蛋白的样品进行比较，同一波长下，脱蛋白样品的吸收值偏低，这可能是因为未脱蛋白的多糖样品中含有一定的核酸及蛋白，这两种物质含有一定数量的碱基和疏水基团，从而使样品的紫外吸收产生增色效应。脱蛋白后，蛋白、核酸被除去，产生增色效应的基团也被除去，样品紫外吸收恢复正常，因而在同一波长下，脱蛋白的多糖样品比未脱蛋白的多糖样品紫外吸收值要略低。

图1 杜香多糖样品紫外扫描光谱Figure 1 UV scanning spectrum of polysaccharide fromLedum palustre L.

2.2 杜香多糖红外分析

由图2可知，谱图在3 389cm－1和1 156～1 024cm－1的峰分别为O—H和C—O的伸缩振动，1 024cm－1的较强吸收也说明了杜香多糖中可能有葡萄糖结构，2 889cm－1的尖峰以及1 567～1 370cm－1的峰分别为C—H的伸缩振动和变角振动，1 648cm－1处出现吸收峰，推测该峰为醛基中CO的伸缩振动引起的，谱图在1 648cm－1波数处还出现一较强的吸收峰，说明杜香多糖中可能有酰氨取代基，谱图在903cm－1波数处还出现吸收峰，说明杜香多糖可能含有β－型糖苷键。总之，杜香水提醇沉物具有多糖的一般吸收峰，证明杜香水提醇沉物为杜香多糖。

图2 杜香多糖的红外光谱图Figure 2 IR spectrum of polysaccharide fromLedum palustre L.

2.3 杜香多糖含量的测定结果

由图3可知：在含量为0.00～0.05mg/mL的范围内，葡萄糖含量与吸光度线性关系良好。标准曲线方程为y＝9.79x－0.002，回归系数R2＝0.995。测得杜香粗提物的吸光值为0.272，从而计算出杜香多糖粗提物中多糖的含量为69.95%。

图3 葡萄糖标准曲线Figure 3 Standard curve of glucose

2.4 杜香多糖抗氧化结果分析

2.4.1 清除DPPH·的能力 由图4可知：抗氧化剂（Vc，BHT等）明显比杜香多糖的清除能力强，这是因为抗氧化剂采用的是纯品，单位体积内浓度相对较高，而制备的杜香多糖粗提物纯度相对较低所致。随浓度升高，杜香多糖对DPPH·的清除率呈明显上升趋势，在0.60mg/mL处，达到54.70%。利用线性关系得出杜香多糖清除DPPH·的EC50值为0.52mg/mL。

图4 杜香多糖与Vc、BHT清除DPPH·能力的比较Figure 4 The scavenging rate of DPPH radical on polysaccharide from Ledum palustre L.compared with Vc，BHT

2.4.2 清除·OH的能力 由图5可知：随浓度升高，杜香多糖和VC对·OH的清除率呈递增趋势；VC对·OH的清除效果明显优于杜香多糖。当浓度为1.00mg/mL时，杜香多糖的清除率为40.97%。利用线性关系得出杜香多糖对·OH的EC50值为1.41mg/mL。

图5 杜香多糖与Vc清除·OH能力的比较Figure 5 The scavenging rate of hydroxyl radical on polysaccharide from Ledum palustre L.compared with Vc

图6 杜香多糖与BHT清除·能力的比较Figure 6 The scavenging rate of superoxide anion radical on polysaccharide fromLedum palustre L.compared with BHT

2.4.4 总还原力 还原能力的测定是以样品是否为有效的电子供应者为评价指标的。若是有效的电子供应者，其供应的电子可将Fe3＋还原成Fe2＋，还可与自由基形成较惰性物质，从而中断自由基连锁反应。一般情况下，物质的吸光度越大，还原能力越强，其抗氧化能力也越高［25］。由图7可知：随浓度增加，吸光度值增加趋势比较平缓，相同浓度时抗氧化剂BHT的总还原能力明显优于杜香多糖。杜香多糖的还原力随浓度的增加呈线性增加，杜香多糖的还原力在0.95～1.00mg/mL范围内高于0.095～0.100mg/mL的BHT的溶液，还原力较强。

2.5 杜香多糖物理性质分析结果

图7 杜香多糖与Vc、BHT还原力的比较Figure 7 The reducing power of polysaccharide fromLedum palustre L.compared with Vc，BHT

图8 杜香多糖失重图（氮气保护）Figure 8 TGA analysis of polysaccharide fromLedum palustre L.under N2condition

2.5.1 热重分析 由图8可知，杜香多糖具有2次明显的失重过程，这与多糖的含水量、组成和聚集态等有关。第1次失重出现在78℃左右，失重率为1.50%，可能是多糖受热失水形成的失重峰；第2次失重出现在190～550℃，失重率为41.97%，此温度区间的失重快，说明杜香多糖在该温度范围内发生了剧烈的分解反应，也说明在190℃以内时，杜香多糖是相对稳定地发生热裂解。550℃以后的温度范围，杜香多糖失重率为13.80%，说明在这个范围内，杜香多糖进一步降解。

2.5.2 X射线衍射分析 由图9可知，杜香多糖的X射线衍射强度曲线最高峰出现在2θ为20°附近，且峰形圆顿，基本呈现典型馒头峰的特性，说明结晶度较低。2θ为30°和40°时，有2个圆顿的小肩峰，也说明了其结晶度低。这可能是因为杜香多糖是由几种多糖混合而成的一种混合性多糖，不同成分的衍射强度曲线的最高峰出现的2θ位置不同，从而产生了肩峰现象。总体来说，杜香多糖的结晶度低（3.6%），分子刚性较差。这也可以作为鉴定杜香多糖的一种方式。

图9 杜香多糖的X－衍射强度曲线图Figure 9 XRD intensity curves of polysaccharide fromLedum palustre L.

3 结论

杜香多糖具有一定的抗氧化活性，并与浓度呈一定的函数关系，且在一定范围内随浓度增高，其活性逐渐增强。杜香多糖清除DPPH·、·、·OH的EC50值分别为0.52，1.41，1.71mg/mL，还原力接近 BHT并与浓度呈正相关。杜香多糖结晶度低，分子刚性差，其在190℃温度范围内稳定，超过该温度，将发生剧烈的热分解使其失重。本试验研究了杜香多糖的理化性质，可为其开发利用提供一定的理论基础。但关于杜香多糖的纯化、单糖分析及结构鉴定仍需进一步的研究。

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