响应面试验优化超声波辅助提取石榴皮中三萜类化合物工艺及动力学分析

王占一，郑丹丹，王京龙，金美花，张立华，王玉海

（1.枣庄学院生命科学学院，山东 枣庄 277160；2.天津医科大学药学院，天津 300070）

响应面试验优化超声波辅助提取石榴皮中三萜类化合物工艺及动力学分析

王占一1，郑丹丹1，王京龙1，金美花2，张立华1，王玉海1

（1.枣庄学院生命科学学院，山东 枣庄 277160；2.天津医科大学药学院，天津 300070）

探讨了超声波辅助提取石榴皮中三萜类化合物的工艺条件，以三萜类化合物得率为考察指标，乙醇体积分数、料液比、超声功率和超声时间为试验因素，通过单因素试验和Box-Behnken试验设计对工艺条件进行优化。在此基础上，建立4 种数学模型对提取过程的动力学进行研究，采用决定系数（R2）、精准因子（Af）、偏差因子（Bf）和根平均方差4 种模型评价参数对模型的适用性进行分析。结果显示：三萜类化合物的最佳提取条件为乙醇体积分数71.2%、料液比1∶20.2、超声功率318 W、超声时间36.7 min，此条件下的三萜类化合物得率达到0.563%；两种非线性增长模型，即：Sgompertz模型和Logistic模型可以更好地拟合动力学过程。超声波辅助提取的工艺参数及所建立动力学数学模型，均可用于石榴皮中三萜类化合物提取过程的工程放大和优化控制。

石榴皮；三萜类化合物；超声波；动力学分析

石榴（Punica granatum L.）又名安石榴、丹若，其干燥果皮入药称为石榴皮，是一种常用中药材，始载于《雷公炮炙论》，也是《中国药典》2010版收载品种[1]。石榴皮中生物活性物质种类丰富，含量较高的成分除了多酚类成分外[2-4]，还有熊果酸、齐墩果酸等三萜类化合物，后者已引起国内研究人员的广泛关注[5-6]。石榴皮中三萜类化合物，在空气中易被氧化变质，传统的溶剂提取方法，耗时较长、提取效率低，不利于有效成分的浸出。超声波辅助溶剂法，通过产生高效的空化效应，使提取过程能够在短时间内完成，从而有效避免了三萜类化合物被氧化而丧失生物活性。在国内，已有学者对该方面进行研究，如马雄等[7]采用超声波辅助溶剂提取法提取石榴皮中熊果酸，并对其最佳工艺通过正交试验进行探究，然而，类似的文献多限于对工艺条件的优化而提高三萜类化合物得率方面的研究，且方法单一，缺乏可靠的理论指导，关于超声波辅助提取动力学方面的研究未见报道。因此，本研究以石榴皮为材料，在传统溶剂提取法基础上，通过Box-Behnken试验设计，优化超声波强化辅助提取工艺条件，并通过建立提取过程的动力学模型及评价体系，为工业化大生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

石榴采自山东峄城“万亩石榴园”产区，经枣庄学院李思健副教授鉴定为石榴科石榴（Punica granatum L.），手工取皮经低温干燥后粉碎到要求粒度，备用；熊果酸标准品（批号：110742-201220） 中国食品药品检定研究院；甲醇、香草醛、冰乙酸、高氯酸、无水乙醇、蒸馏水等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

JA5003B型电子分析天平 上海精科仪器有限公司；TU-1800SPC型紫外-可见光分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；HN-CQY型低温超声波萃取仪 上海汗诺仪器有限公司；FW135型多功能粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的制定[8-10]

精密称取干燥至恒质量的熊果酸标准品5.0 mg于25 mL容量瓶中，以甲醇为溶剂溶解并定容，即得0.2 mg/mL的熊果酸标准品溶液。精确量取熊果酸标准品溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40 mL，分别置于25 mL具塞玻璃比色管中，水浴加热挥尽溶剂，加入0.6 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液（现用现配）和2 mL高氯酸，保持60 ℃反应20 min，冰浴冷却后，加入冰乙酸，充分振摇，于550 nm波长处测定吸光度（A），并以A值为纵坐标，熊果酸系列质量浓度为横坐标，绘制熊果酸标准曲线，求得回归方程为：A=0.034C-0.032 8，R2=0.998 3，熊果酸含量在0～0.011 2 mg/mL范围内与A值之间线性关系良好。

1.3.2 样品处理

精确称取干燥后石榴皮粉末5 g，按照规定的料液比加入设定体积分数的乙醇溶液，置于低温超声波萃取仪中，设定超声功率，提取至设定的反应时间。反应结束后，离心分离所得上清液，回收溶剂，干膏用甲醇溶解并定容至100 mL，作为供试品溶液。精确量取供试品溶液2 mL，按照1.3.1节方法测定A值，计算样品中三萜类化合物含量及得率。

1.3.3 提取工艺优化设计

单因素试验中，考察乙醇体积分数（40%、50%、60%、70%、80%、90%）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35）、超声功率（100、150、200、250、300、350 W）和超声时间（15、20、25、30、35、40 min）对石榴皮中三萜类化合物提取效果的影响。并在单因素试验基础上，采用Box-Behnken试验设计方法，以乙醇体积分数、料液比、超声功率和超声时间为自变量，并依次编码为X1、X2、X3、X4，以石榴皮中三萜类化合物得率（Y）为响应值，通过响应面分析优化超声波辅助提取条件，试验因素水平见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table1 Factors and their coded levels used in response surface design

1.3.4 动力学模型评价参数

采用Af、Bf、根平均方差（root mean square error，RMSE）和R24 个参数评价数学模型的拟合程度[11-14]。Af是精准因子，表示预测值与实测值的偏离程度，Af值越小，模型拟合度越好；Bf是偏离因子，Bf＞1表示实测值比预测值高，Bf＜1表示实测值比预测值低，因此Bf值越接近1，模型拟合度越好。决定系数R2和RMSE表示模型的精确度，R2越接近1，RMSE越小，模型精确度越高。Af、Bf和RMSE计算公式如下：

式中：n表示试验中实测值的数目；obs表示实测值；pred表示预测值。

1.4 数据分析

响应面优化设计采用Design-Expert 8.0.5统计分析软件，图形制作和动力学模型拟合采用Origin Pro 8.0数据处理软件。

2 结果与分析

2.1 三萜类化合物提取工艺参数优化

2.1.1 单因素试验结果

2.1.1.1 乙醇体积分数对三萜类化合物得率的影响

固定料液比1∶20、超声功率250 W、超声时间30 min，考察乙醇体积分数对三萜类化合物得率的影响，结果见图1。

图1 乙醇体积分数对三萜类化合物得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of triterpenoids

由图1可知，随着乙醇体积分数的提高，三萜类化合物得率逐渐提高，在乙醇体积分数达到70%时，三萜类化合物得率达到最高值。随后，随着乙醇体积分数的提高，三萜类化合物得率下降。原因是含水醇为极性溶剂，而三萜类化合物多数为极性化合物，根据“相似者相溶”原理，通过调节溶剂中乙醇与水的比例来调整溶剂极性，保证三萜类化合物有最佳溶解性，因此选择乙醇体积分数为70%。

2.1.1.2 料液比对三萜类化合物得率的影响

固定乙醇体积分数70%、超声功率250 W、超声时间30 min，考察料液比对三萜类化合物得率的影响，结果见图2。

图2 料液比对三萜类化合物得率的影响Fig.2 Effects of solid/liquid ratio on the extraction yield of triterpenoids

由图2可知，料液比对三萜类化合物得率的影响相对较大，随着溶剂用量的增加，三萜类化合物得率随之增加，但是，当料液比在1∶20后，产物得率随料液比变化幅度不大，原因是料液比达到1∶20，在超声作用下，三萜类化合物基本完成从固相向溶剂相的转移，再提高溶剂量不会对产物得率有太大影响，因此，基于经济方面考虑，料液比1∶20为宜。

2.1.1.3 超声功率对三萜类化合物得率的影响

固定乙醇体积分数70%、料液比1∶20、超声时间30 min，考察超声功率对三萜类化合物得率的影响，结果见图3。

图3 超声功率对三萜类化合物得率的影响Fig.3 Effects of ultrasonic power on the extraction yield of triterpenoids

由图3可知，随着超声功率的增大，三萜类化合物得率有随之增大的趋势，原因是随着超声功率增大，超声波产生的空化效应和机械振动作用越强烈，物质的扩散速率越大，三萜类化合物溶出就越快，但是，当超声功率超过250 W后，三萜类化合物得率随超声功率增加变化并不明显，基于节能方面考虑，确定超声功率为250 W。

2.1.1.4 超声时间对三萜类化合物得率的影响

固定乙醇体积分数70%、料液比1∶20、超声功率250 W，考察超声时间对三萜类化合物得率的影响，结果见图4。

图4 超声时间对三萜类化合物得率的影响Fig.4 Effects of extraction time on the extraction yield of triterpenoids

由图4可知，超声时间在10～30 min之间时，三萜类化合物得率不断提高，30 min时得率达到最大值，继续延长超声时间，三萜类化合物得率下降，可能是由于部分产物被分解，或者是原料中杂质不断溶入而影响了提取效果，因此，超声时间初步确定为30 min。

2.1.2 Box-Behnken试验设计及显著性分析

根据Design-Expert 8.0.5统计分析软件提供的数学模型，以三次平行试验中三萜类化合物得率（Y）的平均值作为响应值，响应面试验方案与结果见表2。

对表2数据进行回归拟合，得到石榴皮中三萜类化合物得率（Y）对响应变量X1、X2、X3、X4的回归方程为：

表2 响应面试验方案与试验结果Table2 Arrangement and corresponding results of Box-Behnken experimental dessiiggnn

表3 二次回归方程方差分析结果Table3 Analysis of variance of regression equation

表3为二次回归方程方差分析结果，回归模型的负相关系数R2=0.951 1，P＜0.000 1，说明模型达到极显著水平，失拟项P=0.172 5，影响不显著，模型决定系数=0.902 3，表示可以用此数学模型解释90.23%的变异性；变化系数=3.47%，这个数值相对较小，说明该回归模型可信度较高；一般情况下，认为精密度值大于4是合理的，本试验该值达到13.293。说明该方程拟合良好，可以应用上述方程描述各响应变量与响应值之间的关系，以评价各因素对响应值影响的显著性[15]。

2.1.3 单因素效应分析

将回归方程中的4个自变量中的3 个固定在0水平，分别得到乙醇体积分数（X1）、料液比（X2）、超声功率（X3）、超声时间（X4）的单因素模型。

乙醇体积分数：y=0.55＋0.001 5X-0.08511

图5 响应变量水平与三萜类化合物得率的关系图Fig.5 Triterpenoids yield as a function of four independent variables at fi ve different levels

将4 个响应变量分别固定在-2、-1、0、1、2的5个水平，得到各响应变量的单因素效果图[16-17]。由图5可知，4 个响应变量均为开口向下的抛物线，且各因素的极值点集中在编码0附近，在极值点处，三萜类化合物得率最高，如果偏离极值点，会导致产物得率下降。这为工艺优化结果的取值范围提供了理论参考。

2.1.4 各因素交互效应分析

应用统计分析软件绘制两两因素之间交互影响的响应面图和等高线图[18]，见图6。在此重点考察交互效应显著的乙醇体积分数（X1）和超声功率（X3）、料液比（X2）和超声功率（X3）、超声功率（X3）和超声时间（X4）间的交互效应。

图6 各因素交互作用的响应面与等高线图Fig.6 Response surface and contour plots

由图6可以看出，3 个响应面均为平滑的曲面，且开口向下，说明最大响应值就存在于曲面上，且在所设计的因素水平范围内能够找到最佳工艺条件。影响因素之间，X1与X3交互作用极其显著（P＜0.01），表现为曲线比较陡峭；X2与X3、X3与X4之间交互作用较显著（P＜0.05）。理论上认为，超声波功率越大，溶剂提取系统越容易获得较大的声强，提取效率应该越高。但是超声功率对于三萜类化合物得率的影响并不能一概而论，要充分考虑超声波与介质间的相互作用和提取物质本身的性质。本试验中，3种交互效应均体现出沿X3轴曲线变化密集，说明X3比X1、X2、X4对于响应值的影响大，因此是在提取过程中，超声功率是4个变量中重点考察的因素。

2.1.5 最佳工艺条件的确定及验证

利用Design-Expert 8.0.5统计分析软件对所建立的数学模型进行工艺参数最优化分析，得到石榴皮超声波辅助浸提的最佳工艺条件为乙醇体积分数71.2%、料液比1∶20.2、超声功率318 W、超声时间36.7 min，三萜类化合物得率的模型预测值为0.570%。为了检验工艺参数的准确性，根据上述试验条件进行3 次平行验证实验，测得三萜类化合物平均得率为0.563%，相对误差约为1.24%，说明应用Box-Behnken试验设计所得的最佳工艺参数具有可靠性。

2.2 三萜类化合物提取过程动力学分析

2.2.1 动力学数学模型的建立

精确称取干燥后石榴皮粉末5 g共计15 份，固定乙醇体积分数71.2%、料液比1∶20.2，在不同超声功率条件下（150、200、250、300、350 W）进行超声波辅助提取，反应10 min后，每隔5 min取样0.1 mL，测定提取过程中三萜类化合物质量浓度并计算得率（n=3）。

实验过程中，每次取走样液体积0.1 mL测定三萜类化合物质量浓度，重复11 次，这样将会影响结果的精密度。于是，通过公式（5）修正提取系统三萜类化合物的质量浓度[19-20]：

式中：Cn为第n次取样三萜类化合物质量浓度修正值/（mg/mL）；Ci为第i次取样三萜类化合物质量浓度测定值/（mg/mL）；VT为提取液体积数/mL；n为取样次数，n=1，2，......11。

在不同超声功率提取条件下，石榴皮中三萜类化合物得率随超声时间的变化规律如图7所示。

由图7可以看出，在不同超声功率条件下，三萜类化合物得率均随时间的延长而逐渐提高；超声功率越高，达到提取平衡所需要的时间越短，说明超声功率对提取结果产生了较大的影响。提取过程的前30 min，三萜类化合物得率随时间变化幅度较大；而在提取时间超过30 min后，产物得率随时间变化缓慢。

图7 三萜类化合物得率与超声时间的关系Fig.7 Relationship between triterpenoids yield and ultrasonic time

采用Origin Pro8.0软件对图7中试验数据进行模型拟合[21]，并以Af、Bf、RMSE和R24 个参数评价数学模型的拟合程度[11-14]。结果见表4。

表4 不同超声功率条件下动力学数学模型Table4 Kinetic mathematical models under different ultrasonic powers

由表4可知，Origin Pro8.0软件中固有的2 种指数函数模型（Asymptotic1模型、Expdecay1模型）和2 种非线性增长函数模型（Logistic模型、Sgompertz模型）均能很好地拟合三萜类化合物提取得率曲线。通过对Af、Bf、RMSE和R24个模型拟合参数的综合分析可以得出：Logistic模型和Sgompertz模型的Bf、R2值更接近1，Af、 RMSE值更小，其中，超声功率在150、250、350 W提取条件下，Logistic模型的4 种模型拟合参数值达到最佳，模型达到最优拟合；而超声功率在200、300 W提取条件下，Sgompertz模型的拟合参数值达到最佳，模型达到最优拟合。

2.2.2 模型预测结果的验证

为了更好比较不同超声功率条件下，最优模型的预测值与实测值之间的相关性，以实测值为横坐标，模型预测值为纵坐标求算二者之间的拟合方程，探索线性关系[12,14]，结果见表5。

表5 不同超声功率条件下最优模型预测值与真实值拟合方程Table5 Fitting equations between predicted values from the optimal model and actual values under different ultrasonic powers

由表5可知，不同功率条件下，拟合方程的相关系数R2均大于0.997 5，这说明，最优模型预测值与真实值之间呈现良好相关性。因此，在本实验中，Logistic模型和Sgompertz模型这2种非线性增长函数模型，是描述石榴皮中三萜类化合物提取动力学过程的最佳数学模型。

3 讨论与结论

国内外已有文献报道超声波辅助提取红缘拟层孔菌[22]、神秘果叶[23]、北五味子果实及叶[24]等材料中三萜类化合物的工艺条件，结果显示，超声波辅助提取工艺时间短、效率高。本实验研究了超声波辅助提取石榴皮三萜类化合物的工艺条件，产物得率为0.563%，超声时间为36.7 min，和国内同类研究[6,25]相比较，结果令人满意。在天然产物提供动力学模型研究领域，Logistic模型已有相关报道[21]，而Sgompertz模型则鲜有报道。

超声波辅助提取石榴皮中三萜类化合物工艺中，影响产物得率的各因素主次顺序为：超声时间＞料液比＞超声功率＞乙醇体积分数。最优工艺条件为乙醇体积分数71.2%、料液比1∶20.2、超声功率318 W、超声时间36.7 min，三萜类化合物平均得率为0.563%。对不同超声功率条件下三萜类化合物得率随时间的动力学变化采用了4 种动力学模型进行拟合，用Af、Bf、RMSE和R24 个模型拟合参数对拟合结果进行判定。结果显示：超声功率在150、250、350 W条件下，Logistic模型拟合效果最佳；而超声功率在200、300 W条件下，Sgompertz模型得到最优拟合，模型的预测值与实测值之间的拟合程度很高。

参考文献：

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典[S]. 北京: 中国医药科技出版社, 2010: 87.

[2] 张立华, 张元湖, 杨雪梅. 石榴不同部位提取物抗油脂氧化剂抗菌活性的比较研究[J]. 中国粮油学报, 2010, 26(4): 38-42.

[3] 陆雪莹, 热依木古丽·阿卜都拉, 李艳红, 等. 新疆石榴皮总多酚有效部位的抗氧化、抗菌剂抗肿瘤活性[J]. 食品科学, 2012, 33(9): 26-30.

[4] 房玉林, 齐迪, 郭志君, 等. 超声波辅助法提取石榴皮中总多酚工艺[J].食品科学, 2012, 33(6): 115-118.

[5] 热娜·卡斯木, 帕丽达·阿不力孜, 张笑颖. 新疆石榴皮化学成分研究[J]. 中药材, 2009, 32(3): 363- 365.

[6] 查孝柱, 谢晓梅, 吕美红, 等. 含齐墩果酸和熊果酸的10 种果实类中药HPLC分析[J]. 中国实验方剂学杂志, 2010, 16(18): 60-62.

[7] 马雄, 陶亮亮, 刘柯彤, 等. 超声波辅助提取石榴皮中熊果酸工艺研究[J]. 云南化工, 2010, 37(2): 81-83; 86.

[8] 戴娇娇, 陶华明, 朱全红, 等. 蔓茎堇菜总黄酮和总三萜的含量测定[J].中国现代应用药学, 2012, 29(2): 166-169.

[9] 尤努斯江·吐拉洪, 木妮热·伊布拉音, 吐尔洪·买买提, 等. 阿里红中总三萜酸的提取工艺优化及总量测定[J]. 中国实验方剂学杂志, 2012(18): 24-27.

[10] 陈震鸣, 陶文沂, 许泓瑜. 乙醇提取樟芝粉三萜类化合物的动力学研究[J]. 食品科学, 2009, 30(3): 21-24.

[11] ROSS T. Indices for performance evaluation of predictive models in food microbiology[J]. Journal of Applied Bacteriology, 1996, 81(2): 501-508.

[12] 钟葵, 吴继红, 廖小军, 等. 高压脉冲电场对植物乳杆菌的杀菌效果及三种模型的比较分析[J]. 农业工程学报, 2006, 22(11): 238-243.

[13] 董庆利, 郭黎洋, 屠康, 等. 不同试验条件下生孢棱菌孢子生长预测方程的建立[J]. 浙江大学学报: 农业与生命科学版, 2007, 33(2): 162-168.

[14] 黄六容, 李云亮, 段玉清, 等. 金耳菌丝体多糖的超声波辅助提取与动力学模型[J]. 林产化学与工业, 2011, 31(2): 7-11.

[15] 侯学敏, 李林霞, 张直峰, 等. 响应面优化薄荷叶总黄酮提取工艺及抗氧化活性[J]. 食品科学, 2013, 34(6): 124-128.

[16] 王居伟, 马挺军, 陕方, 等. 超高压提取苦荞麦黄酮的工艺优化及动力学模型[J]. 中国粮油学报, 2011, 26(12): 93-99.

[17] 王居伟, 马挺军, 贾昌喜. 超高压提取大豆皂苷的工艺优化及动力学模型[J]. 中国食品学报, 2012, 12(4): 8-18.

[18] 王雪, 王振宇. 响应面法优化超声波辅助提取黑木耳多糖的工艺研究[J]. 中国林副特产, 2009, 24(6): 1-5.

[19] 程伟, 秦俊哲, 杜军国. 桑黄多糖提取过程模型的建立与动力学分析[J]. 现代食品科技, 2013, 29(3): 513-518.

[20] 赵鹏, 张丽华. 款冬花多糖提取过程的动力学模型[J]. 中国医院药学杂志, 2012, 32(18): 1434-1437.

[21] 郭庆启, 张娜, 孙瑶, 等. 超声波辅助提取落叶松树皮多酚的动力学和热力学研究[J]. 北京林业大学学报, 2014, 36(3): 115-120.

[22] 陈先晖, 袁博, 鞠秀云, 等. 响应曲面法优化超声波提取红缘拟层孔菌总三萜工艺[J]. 食品科学, 2010, 31(20): 6-10.

[23] 卢圣楼, 刘红, 臧文霞, 等. 响应面法优化神秘果叶总三萜的超声波提取工艺[J]. 林产化学与工业, 2013, 33(6): 95-100.

[24] 崔福顺, 李官浩, 金清. 超声波提取北五味子果实及茎叶总三萜的研究[J]. 食品研究与开发, 2013, 34(7): 53-56.

[25] 袁恩光, 李国梁, 吴宏亮, 等. 柱前荧光标记法结合HPLC-FLD测定石榴中四种三萜酸[J]. 天然产物研究与开发, 2015, 27(2): 214-220.

Optimization and Kinetic Analysis of Ultrasonic-Assisted Extraction of Triterpenoids from Pomegranate Rind

WANG Zhanyi1, ZHENG Dandan1, WANG Jinglong1, JIN Meihua2, ZHANG Lihua1, WANG Yuhai1
(1. College of Life Science, Zaozhuang University, Zaozhuang 277160, China; 2. College of Pharmacy, Medical University of Tianjin, Tianjin 300070, China)

This study examined the ultrasonic-assisted extraction conditions of triterpenoids from pomegranate rind. Single factor method and Box-Behnken experimental design were used to optimize the extraction process employing triterpenoids yield as the response and ethanol concentration, solid/liquid ratio, ultrasonic power and extraction time as the independent variables. Using the optimized extraction conditions, the kinetics of the extraction process was studied by establishing four mathematical models, and the applicability of these models was analyzed by four model evaluation parameters including coeffi cient of determination (R2), accuracy factor (Af), bias factor (Bf) and root mean square error (RMSE). Results showed that the optimal extraction conditions for triterpenoids were determined as follows: ethanol concentration, 71.2%; solid/ liquid ratio, 1:20.2; ultrasonic power, 318 W; and ultrasonic time, 36.7 min. Under these conditions, the yield of triterpenoids was 0.563%, and two nonlinear growth models, namely Sgompertz model and Logistic model, could better fi t the kinetics. Both the optimized ultrasound-assisted extraction technique and the kinetic mathematical models can be used for industrial scale-up and optimal control of triterpenoids extraction from pomegranate rind.

pomegranate rind; triterpenoids; ultrasonic; kinetic analysis

R284.2

A

1002-6630（2015）22-0011-07

10.7506/spkx1002-6630-201522003

2015-03-30

2012年度国家星火计划项目（2012GA740049）；山东省自然科学基金项目（ZR2013BL018）

王占一（1980—），男，讲师，硕士，主要从事天然药物活性成分提取与分离研究。E-mail：zhyiwang@126.com