温度对金带细鲹鱼肉水解物美拉德反应及其产物抗氧化性的影响

卢 彬 王忠合 王 军 邹 敏 傅 力

（1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.韩山师范学院生物系，广东 潮州 521041）

近年来，有关鱼类蛋白酶水解物抗氧化活性的研究引起了人们的广泛关注，如鲢鱼蛋白［1］、罗非鱼内脏蛋白［2］、金带细鲹鱼肉蛋白［3］、金枪鱼肝脏蛋白［4］等。虽然酶水解产物具有一定的抗氧化活性，但远不如人工合成的抗氧化剂活性高［5］。美拉德反应是食品中羰基和氨基之间的非酶促褐变反应［6］。美拉德反应不仅能使食品具有独特的风味和诱人的色泽，而且美拉德反应产物（maillard reaction products，MRPs）中的类黑素、还原酮及一些含氮硫的杂环化合物均具有较强的抗氧化活性［7］。刘蒙蒙等［8］研究表明，罗非鱼鱼皮胶原肽与葡萄糖发生美拉德反应后，产物的抗氧化性相较于原胶原肽有显著提高。尤娟等［9］发现，鲢鱼鱼肉蛋白酶水解物与葡萄糖在60℃下，以1∶4（m∶m）的比例进行糖基化反应，得到的MRPs清除DPPH自由基能力较强。

金带细鲹（Selaroidesleptolepis）为近海暖水性鱼类，体长可达18cm，中国产于南海、台湾海峡，摄食浮游动物和底栖动物，含有丰富的蛋白质、维生素类、钙等营养元素，且价格相对较低。作为原料加工的产品多为一些脱水鱼干、鱼粉等低附加值产品，也是一种未充分利用的大宗低值鱼。本研究拟以金带细鲹鱼肉蛋白为原料，研究温度对金带细鲹鱼肉蛋白水解物美拉德反应及其MRPs抗氧化活性的影响，进一步分析MRPs中具有抗氧化活性组分的产生过程、在整个反应过程中的变化趋势以及抗氧化形成机理，旨在为金带细鲹鱼高值化利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

金带细鲹：购于广东省潮州市枫春市场；

胰蛋白酶：3 000～3 500NFU/mg，生工生物工程（上海）有限公司；

菲洛嗪、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）：分析纯，美国Sigma公司；

葡萄糖：分析纯，广东光华化学厂有限公司；

其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 主要仪器设备

紫外可见分光光度计：UV-2800型，尤尼科（上海）仪器有限公司；

冷冻干燥机：FD-1D-50型，北京博医康实验仪器有限公司；

离心机：2-16P型，美国Sigma公司；

pH计：PHSJ-4A型，上海仪电科学仪器股份有限公司；

电子恒温水浴锅：B056028型，深圳市国华电子有限公司。

1.2 方法

1.2.1 鱼肉蛋白水解物的制备 鱼肉糜按质量比1∶3的比例与水混合，用6mol/L NaOH调节pH至8.0，酶解温度为50℃，加1%（m/m）的胰蛋白酶（［E］/［S］＝1∶100）酶解3h，在酶解过程中用2mol/L NaOH调节溶液pH不变。酶解结束后100℃灭酶10min，将酶解液在10 000r/min离心10min，上清液冷冻干燥24h后，将制备好的水解物置于密封袋中，在－18℃下保存备用。

1.2.2 不同条件下美拉德反应体系的制备 将制备好的水解物溶解在蒸馏水中，按鱼肉蛋白水解物与葡萄糖质量比1∶2加入葡萄糖，用1mol/L NaOH调节pH至9.0，最后将鱼肉蛋白水解物浓度为25mg/mL的溶液置于20mL具塞密闭试管中分别在100，120 ℃下反应0，1，2，3，4，5，6h（MRPs-100、MRPs-120分别表示100，120 ℃下所得的反应产物）。反应完毕后，立即取出置于冰水冷却至室温，测定pH值，然后置于－18℃冷冻备用。同时按上述相同试验条件，以不加葡萄糖的作为对照（对照-100、对照-120分别表示在100，120℃单独加热的鱼肉蛋白水解物）。

1.2.3 中间产物和褐变程度的测定 根据文献［10］修改如下：反应样液用蒸馏水稀释100倍和50倍，以蒸馏水做参比，分别在294nm和420nm下测定吸光度。

1.2.4 游离氨基含量的测定 根据文献［11］修改如下：取用蒸馏水稀释25倍后的样液125μL，加入0.212 5mol/L pH 8.2的磷酸盐缓冲液2.0mL和0.01%的TNBS溶液1.0mL，混匀，置于50℃水浴中暗处反应30min。反应后加入0.1mol/L的亚硫酸钠2.0mL终止反应，室温下冷却15 min，于420nm处测定吸光度。以L-亮氨酸为标样绘制标准曲线。游离氨基含量表示为处理后的样液的游离氨基数占处理前样液游离氨基数的百分比。

1.2.5 美拉德反应产物抗氧化活性的测定

（1）DPPH自由基清除率：根据文献［12］修改如下：称取一定量的DPPH，用无水乙醇配制成0.15mmol/L的溶液。取2mL用蒸馏水稀释25倍后的样品溶液与2mL DPPH溶液混合均匀，室温暗处反应30min后，于517nm处测定吸光度A2。同时测定2mL DPPH与2mL无水乙醇溶液混合后的吸光度A0；2mL样液与2mL无水乙醇溶液混合后吸光度A1。DPPH自由基的清除率用式（1）计算：

式中：

R——DPPH自由基清除率，%；

A0——乙醇加DPPH溶液的吸光度；

A1——乙醇加样液的吸光度；

A2——样液加DPPH溶液的吸光度。

（2）还原力：根据文献［13］修改如下：在10mL离心管中分别加入0.2mol/L pH 6.6的磷酸盐缓冲液2mL和用蒸馏水稀释25倍后的样品溶液2mL，加入1%铁氰化钾2 mL，混合均匀后于50℃反应20min。取出加入2mL 10%三氯乙酸终止反应，5 000r/min离心10min。取上清液2 mL，加入去离子水2mL和FeCl30.5mL，混匀后静置10 min，在700nm处检测吸光度。吸光度的大小表示还原力的强弱。

（3）羟自由基清除率：根据文献［14］修改如下：取用蒸馏水稀释25倍后的样品溶液1mL，加入9mmol/L FeSO40.25mL和9mmol/L水杨酸—乙醇溶液0.25mL，混匀后，加入1.5mL蒸馏水。最后加1mL 8.8mmol/L H2O2启动反应，在37℃反应30min，以蒸馏水为参比，在510nm下测定各样液的吸光度A2。以1mL蒸馏水代替样液，测定在510nm处的吸光度A0；以1mL蒸馏水代替H2O2，测定在510nm处的吸光度A1。按式（2）计算羟自由基清除率：

式中：

R——羟自由基清除率，%；

A0——蒸馏水代替样液后在510nm处的吸光度；

A1——蒸馏水代替H2O2后在510nm处的吸光度；

A2——加入样液后在510nm处的吸光度。

（4）Fe2＋螯合力的测定：根据文献［15］修改如下：取用去离子水稀释25倍后的样品溶液1mL，加入去离子水1.85mL和2mmol/L的FeCl2溶液0.05mL，混合均匀室温静置30s，再加入5mmol/L的菲洛嗪溶液0.1mL，室温下静置10min，3 000r/min离心5min后于562nm处测定其吸光度A2。以1mL去离子水代替样液，测定在562nm处的吸光度A0；以0.1mL去离子水代替菲洛嗪，测定562nm处的吸光度A1。按照式（3）计算螯合力：

式中：

R——Fe2＋螯合力，%；

A0——去离子水代替样液后在562nm处的吸光度；

A1——去离子水代替菲洛嗪后在562nm处的吸光度；A2——加入样液后在562nm处的吸光度。

1.3 数据分析

试验重复测定3次，结果表示为平均值±标准偏差SD。数据统计分析采用SPSS 19.0软件进行一维方差分析（oneway ANOVA），差异显著性采用Duncan（邓肯）检验，检验水平P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 鱼肉水解物水解度的测定

前期试验发现，采用胰蛋白酶水解金带细鲹鱼肉3h后，水解物的抗氧化性和功能特性较好，测定水解度为20.18%。

2.2 反应产物pH值的变化

由图1可知，MRPs-100的pH值随着反应时间的延长缓慢降低（P＜0.05）。MRPs-120的pH 值在前4h急剧降低（P＜0.05），4h后pH值趋于平缓。pH值的降低主要是因为美拉德反应过程中糖和水解产物受热发生降解生成一些有机酸，包括甲酸和乙酸以及其他可能形成的乳酸、丙酮酸、柠檬酸和糖精酸等［13］。对照组pH值无显著变化（P＞0.05）。

2.3 中间产物和褐变程度的变化

如图2所示，MRPs-120的A294nm和A420nm显著高于MRPs-100下的吸光值（P＜0.05）。此结果与 Yilmaz等［16］的研究相一致，MRPs-120的颜色与MRPs-100相比，变为更深的深褐色。对照（100，120℃）的A294nm无明显变化，而A420nm略有升高，原因可能是金带细鲹水解产物中含有少量的还原糖，加热导致还原糖的焦糖化反应或者糖与肽之间的美拉德反应。

图1 美拉德反应产物的pH值随时间的变化Figure 1 Changes in pH value of MRPs as a function of reaction times

图2 美拉德反应产物的中间产物和褐变程度随时间的变化Figure 2 Changes in the intermediate compounds and the browning intensity of MRPs as a function of reaction times

2.4 游离氨基含量的变化

游离氨基的含量变化是用来比较美拉德反应程度的指标［17］。如图3所示，反应最初2h游离氨基的含量迅速下降，反应2h时MRPs-120的游离氨基的损失速率是 MRPs-100的2.88倍，反应2h之后游离氨基的含量变化不显著（P＞0.05）。在美拉德反应的初期阶段，肽类或者蛋白质的α－氨基和赖氨酸残基的ε－氨基与葡萄糖的羰基发生反应，造成这些高活性游离氨基大量减少，而其它氨基难以被利用，因而加热处理后期游离氨基含量变化不明显［18］。对照组游离氨基酸的含量无显著变化（P＞0.05）。

2.5 DPPH自由基清除活性

如图4所示，反应时间前3h内，MRPs-120的DPPH清除率显著增大，在4～6h时趋于平缓。而MRPs-100的DPPH自由基清除率显著低于 MRPs-120（P＜0.05）。MRPs-100、MRPs-120对 DPPH 自由基清除率最大值分别为26.12%和82.70%。对照组DPPH自由基清除活性随着反应时间延长略微增大，当在6h时，对照-120的DPPH自由基清除率只达到19.04%。研究发现MRPs的DPPH自由基清除活性在一定程度上与褐变程度有关，这可能是因为美拉德反应在高级阶段会形成褐色高分子聚合物类黑精，此类物质具有显著的抗氧化性［19］。

图3 美拉德反应产物的游离氨基含量随时间的变化Figure 3 Changes in free amino group content of MRPs as a function of reaction times

图4 美拉德反应产物的DPPH自由基清除率随时间的变化Figure 4 Changes in DPPH radical scavenging activity of MRPs as a function of reaction times

2.6 还原力

如图5所示，随着反应时间的延长，MRPs-100和MRPs-120的还原力都显著增大（P＜0.05），相比于 MRPs-100，MRPs-120表现出了较强的还原力。反应6h后，MRPs-120的还原力是 MRPs-100的2.16倍，是对照-120的7.19倍。Jiang等［20］也发现，在整个美拉德反应过程中，MRPs的还原能力随反应时间的增加而增加。对照组反应6 h后其还原力无明显变化（P＞0.05）。

2.7 羟基清除活性

由图6可知，随着反应时间的延长，MRPs-100和MRPs-120的羟基清除率逐渐降低，相比未反应前分别降低11.81%和17.27%。而对照组羟基清除率基本没有变化（P＞0.05）。结果说明美拉德反应使金带细鲹鱼肉水解产物的羟基清除活性下降。这与刘蒙蒙等［8］的研究结果不一致。

图5 美拉德反应产物的还原力（A700nm）随时间的变化Figure 5 Changes in Reducing power of MRPs as a function of reaction times

图6 美拉德反应产物的羟自由基清除率随时间的变化Figure 6 Changes in Hydroxyl radical scavenging activity of MRPs as a function of reaction times

2.8 Fe2＋螯合能力

如图6所示，随着反应时间的延长，对照组Fe2＋螯合力无显著变化（P＞0.05），MRPs-100的Fe2＋螯合力略有减少，反应6h后其Fe2＋螯合力相比对照-100减少5.60%，而MRPs-120的Fe2＋螯合力显著减少，反应6h后其Fe2＋螯合力相比未反应前减少67.37%。其原因可能是因为金带细鲹鱼肉水解产物中一些游离氨基酸、肽链和蛋白质，其侧链上的氨基和羧基能与Fe2＋配位，但高温下美拉德反应使这类物质大量减少，导致Fe2＋螯合能力也随之减弱［21］。

图7 美拉德反应产物的Fe2＋螯合率随时间的变化Figure 7 Changes in Fe2＋chelating ability of MRPs as a function of reaction times

3 结论

（1）当反应温度为120℃时，反应体系的pH值和游离氨基酸含量与100℃时相比显著降低，中间产物及褐变程度急剧增加，对照组没有显著变化。说明较高的反应温度下，能够促进金带细鲹鱼肉蛋白水解物与葡萄糖美拉德反应的进行。

（2）当反应温度为120℃时，反应产物的DPPH自由基清除率和还原力与100℃时相比大幅度提高，对照组没有显著变化。有研究表明［19］DPPH自由基清除率和还原力在一定程度上与褐变程度有关，可能是因为美拉德反应在高级阶段会形成褐色高分子聚合物类黑精，此类物质具有显著的抗氧化性。而羟基清除率和Fe2＋螯合力的降低，可能是因为某种游离氨基酸或肽的含量大量减少导致，具体原因还有待进一步的研究探讨。

（3）虽然较高反应温度够促进美拉德反应的进行和抗氧化活性物质的生成，但也会生成一些对人体有害的物质如中级产物羟甲基糠醛、丙烯酰胺和晚期产物羧甲基赖氨酸等。如何抑制此类物质的生成，而又不影响MRPs的抗氧化活性，需进一步的分析研究。

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