酸性电解水处理后南美白对虾贮藏过程中肠道微生物的多样性变化

付娇娇，彭织云，刘海泉，孙晓红，潘迎捷，赵　勇，*

（1.上海海洋大学食品学院，上海201306；2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海201306；3.农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（上海），上海201306）

酸性电解水处理后南美白对虾贮藏过程中肠道微生物的多样性变化

付娇娇1，2，3，彭织云1，2，3，刘海泉1，2，3，孙晓红1，2，3，潘迎捷1，2，3，赵勇1，2，3，*

（1.上海海洋大学食品学院，上海201306；2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海201306；3.农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（上海），上海201306）

肠道微生物是引起水产品腐败变质的主要污染源之一。酸性电解水（AEW）作为新型环保消毒剂，因其高效广谱杀菌的特点，已逐渐被应用于水产品安全控制方面并且日益受到人们的重视。本研究采用变性梯度凝胶电泳技术，分析了经自来水（TW）与酸性电解水分别处理的南美白对虾（Penaeus vannawei）于0、4、25℃贮藏过程中肠道微生物多样性的变化规律。结果表明，与对照相比，经酸性电解水处理后的样品肠道微生物多样性在贮藏过程中有所减少。因此，酸性电解水能明显改变肠道微生物的多样性，为其保障水产品质量安全提供了理论参考依据。

南美白对虾，酸性电解水，肠道微生物，变性梯度凝胶电泳（DGGE）

南美白对虾因其营养价值高、肉质鲜美而广受消费者喜爱，但其在运输、生产加工、贮藏过程中易腐败变质[1]。近年来，蓝蔚青等[2]探讨了鲳鱼冷藏过程中不同种类细菌的变化规律。陈慧斌等[3]研究了4℃冷藏期间牡蛎鳃部菌群的动态变化，但很少有人关注水产品贮藏过程中肠道细菌的种群变化。肠道微生物是引起水产品腐败变质的主要因素之一，因此，研究水产品肠道细菌结构在贮藏过程中的变化规律尤为重要。通过选择不同的保鲜剂和包装方式，可以改善水产品的贮藏品质，延长货架期[4]。已有研究表明乳酸菌生物保护剂可以有效抑制冷冻水产品中单增李斯特菌的生长[5]。徐晓瑾等[6]研究发现气调包装是一种有效地抑菌包装方式，可延长生鲜冷却牛肉的保鲜期。相比于其他化学杀菌剂，酸性电解水具有安全性好，快速、广谱杀菌的特点[7-8]。因此，研究电解水在食品安全方面的应用具有现实意义。蓝蔚青等[9]研究表明酸性电解水能在短时间内抑制细菌生长，使带鱼的冷藏货架期延长2～3d。谢军等[10]发现酸性电解水能有效减少虾体细菌总数，但酸性电解水在延长水产品货架期的同时是否改变了其肠道微生物的结构尚未见报道。

PCR-DGGE技术被广泛应用于微生物菌落多样性和种群差异研究，目前已经成为微生物分子生态学研究的主要方法之一[11-13]。本文基于PCR-DGGE技术，分析了经自来水与酸性电解水处理后南美白对虾肠道微生物种群结构多样性的变化规律，为进一步控制南美白对虾贮藏过程中的腐败变质及酸性电解水技术在水产品安全中的应用提供了参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

南美白对虾购于上海市普陀区铜川路水产品市场。实验选取相同规格的个体（平均约25g），将其分为A、B两组，样品分别编号a～r。A组用自来水，B组用50ppm的酸性电解水分别浸泡1min后放入均质袋中，置于0、4、25℃条件下贮藏。分别采集贮藏0、1、3、4、6d虾肠道0.1g于1.5mL离心管中，-80℃保存。

FW-200型强酸性电解水生成器日本Amano公司；高精度恒温培养箱日本Sanyan公司；BagMixer 400 VW型拍打式均质器法国Interscience公司；离心机、PCR扩增仪德国Eppendorf公司；DGGE电泳仪、Bio-Rad凝胶成像仪分析系统美国BioRad公司；PCR试剂盒中国上海LifeFeng公司；肠道DNA提取试剂盒德国Qiagen公司；酶标仪美国BioTek公司。

1.2实验方法

1.2.1肠道微生物群落总DNA提取使用肠道DNA提取试剂盒提取肠道样品的总DNA，提取步骤按说明书操作，提取后的DNA置于-20℃保存待用。

1.2.2PCR扩增选取细菌16S rDNA的V3可变区进行PCR扩增。引物序列如下：上游引物V3-2：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’和带GC夹子的下游引物V3-3：5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGC GGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’。25μL PCR反应体系为：PCR mix 12.5μL、引物V3-2和V3-3各1μL、ddH2O 8.5μL，DNA模板2μL。PCR扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸30s，20个循环；72℃延伸10min。取5μL PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，DNA Marker选用DL2000，紫外检测扩增产物，凝胶成像。

1.2.3变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）将PCR产物用DGGE分离，凝胶的配制采用8%聚丙烯酰胺凝胶，其中变性剂浓度梯度为35%～60%（100%的变性胶包含7mol/L尿素和40%甲酰胺）。PCR扩增产物上样量为8μL，上样前调整PCR产物的浓度使浓度一致。采用D code DGGE（Bio-Rad）进行电泳，电泳缓冲液为1×TAE（Tris-磷酸），在60℃条件下120V电压电泳4h左右。凝胶染色，电泳结束后，凝胶于EB染液中染色20min，用Bio-Rad凝胶成像系统采集图像。

1.3数据分析

利用Quantity One 4.6.2软件将DGGE图谱数字化后得到每个样品中可检测条带的细菌丰度，有条带记为“1”，无条带则记为“0”。将输出的数据结果导入NTSYS-pc 2.10e软件，比较各个泳道之间的相似性，并进行UPGAMA聚类分析并采用Canoco for Windows 4.5软件进行主成分分析。根据电泳图谱中每个条带的亮度，用香浓-威纳多样性指数（Shanno-Wiener index，H）分析各样品多样性。公式如下：

式中，H为香浓-威纳多样性指数，S为DGGE胶中条带数量，Pi为i条带所占百分比。

2　结果与分析

2.1DGGE图谱分析及多样性分析

18个样品的DGGE电泳结果如图1所示。不同位置的条带代表不同种属细菌，条带的荧光强度则反映了该细菌的丰富度，条带信号越亮，表示该种属细菌的相对数量越多[14]。由图1可知，每个样品中强度高的条带在泳道中的迁移率不同，说明各样品中优势菌群有所不同，直观地反映了南美白对虾贮藏过程中肠道微生物的多样性。比较图1中0℃贮藏条件下自来水（TW）与酸性电解水（AEW）分别处理的样品，其肠道细菌的结构存在明显的多样性差异，此现象同样出现在4℃及25℃条件贮藏过程中。表明酸性电解水改变了肠道微生物的多样性。

图1　各样品16S rDNA基因扩增产物的DGGE电泳结果Fig.1　DGGE electrophoresis of 16S rDNA gene amplification products from the samples

根据DGGE图谱数字化结果可得，经自来水处理于0、4、25℃条件下贮藏的三组样品（a、c、e、g，i、k、m，o、q）分别在DGGE图谱上产生11、9、12、13，11、10、13，10、11条可以鉴别的条带；同样，经酸性电解水处理于0、4、25℃条件下贮藏的三组样品（b、d、f、h，j、l、n，p、r）分别在DGGE图谱上产生11、10、13、9，15、13、10，11、10条可以鉴别的条带，条带数量的多少反映了该样品代表的肠道环境中细菌的多样性程度。结果显示，自来水处理的样品在0、4、25℃条件下贮藏过程中，其肠道微生物菌群结构多样性呈上升趋势，而在酸性电解水处理样品中有所下降，表明酸性电解水对虾肠道细菌增殖有一定的抑制作用。观察DGGE图谱中S位置上的条带，发现其在泳道上处于相似位置。该结果可推测贮藏过程中对虾肠道内存在某一稳定增殖的细菌，但并不能认为这些条带所代表的就一定是同样的细菌。

多样性指数（H′，Shannon-wiener index）是研究群落物种数和个体数及其分布均匀度的综合指标[15]。由表1可知，多样性指数在整个监测周期内呈周期性波动变化，说明了对虾肠道内微生物群落结构在时间上的演替变化。分析0℃及4℃贮藏条件下的两组样品，发现贮藏时间达到48h之后，肠道菌群的多样性开始明显增加，表明肠道细菌种类在贮藏前期发生了改变。此外，酸性电解水处理后的样品在贮藏48h时肠道细菌的多样性指数最低，表明其高效的抑菌作用。分析25℃条件下贮藏的样品，实验结果显示当贮藏时间达到24h时，酸性电解水处理样品的肠道细菌多样性指数略低于自来水处理样品，可进一步表明酸性电解水的抑菌作用。

表1　样品细菌种群多样性指数Table.1　Shannon-Wiener index

2.2DGGE图谱的聚类分析及主成分分析

UPGAMA相似性聚类分析结果（表2）显示，所有样品相似性在0.44～1.0，说明各样品肠道种群结构有所差异。由图2可知，不同贮藏温度下，自来水与酸性电解水处理的第0d肠道样品被聚为一类，显示出它们具有较为相似的种群结构，其平均相似系数为0.93。随着贮藏时间的增加，样品间的相似系数逐渐降低，如酸性电解水处理样品于4℃贮藏第0d与第3d的相似系数仅为0.44，表明酸性电解水明显改变了肠道微生物的多样性及肠道微生物种类变化主要发生在贮藏前期。

图2　DGGE图谱的聚类分析Fig.2　Cluster analysis of DGGE fingerprinting profile

表2　样品肠道微生物相似系数Table.2　Similarity coefficients of intestinal microorganisms of samples

DGGE图谱的PCA分析结果如图3所示。样品之间的距离代表了它们的差异大小。主成分因子1（PC1）的贡献率为32.9%，主成分因子2（PC2）的贡献率为14.4%；PC1明显地将样品分成2个部分，自来水处理的样品（1～9）集中分布在图的左边，酸性电解水处理的样品（10～18）分散在图的右边。表明自来水处理与酸性电解水处理的样品肠道细菌结构多样性存在明显差异。此外，图中酸性电解水处理的样品分布比较发散，表明其明显影响了肠道微生物的多样性。图中8、9是经自来水处理于25℃条件下贮藏第0d与第1d的肠道样品，该贮藏温度下的样品间距相差较大，此现象同样出现在酸性电解水处理组（17～18）。表明在25℃环境条件下，细菌适宜生长从而使肠道微生物多样性发生了较大的改变。

图3　DGGE图谱的PCA分析Fig.3　PCA analysis of DGGE fingerprinting profile

3　结论与讨论

DGGE方法有不需要培养、分辨率高、结果准确可靠、重复性好、检测速度快、可同时检测多种微生物等优点[16]，在本研究中，16S rDNA V3区的PCRDGGE图谱能够很好地区分虾肠道内的细菌，虽然数据不能代表所有对虾肠道内细菌群落的情况，但可以说明PCR-DGGE技术能够有效地用于肠道菌群的分析。

酸性电解水作为一种新型的环保杀菌剂，已逐步应用于食品保鲜中。近年来，国内外学者均有关于电解水杀菌效果的研究报道。李秀丽等[17]研究表明酸性电解水能有效减少熟制虾仁中的细菌总数；李华贞等[18]研究表明酸性电解水可以抑制新鲜果蔬中的细菌增殖，延长其保鲜期。林婷、Abdulsudi等[19-20]研究结果同样表明酸性电解水具有高效的抑菌作用，而这些研究都是基于酸性电解水对食品表面微生物的作用效果。由于肠道微生物也是引起水产品腐败变质的主要污染源之一，所以本研究重点关注酸性电解水处理后的水产品在贮藏过程中肠道微生物多样性的变化。由实验结果可知，酸性电解水处理的虾样肠道微生物多样性在贮藏过程中有所减少并且与对照组存在明显差异，不仅进一步证明了酸性电解水具有高效抑菌的作用，同时揭示了其能够显著影响水产品肠道微生物的多样性，这可能与延长水产品货架期有关。研究还发现经两种不同方式处理的样品，其肠道微生物优势种群在贮藏前期都发生了明显的改变，因此在鲜虾安全控制中应在前期采取有效措施以改善食品品质。此外，DGGE图谱中S位置上的条带细菌在样品贮藏过程中稳定存在，但不能认为就是同一种细菌，这些细菌可能是引起水产品贮藏过程中腐败变质的特定腐败菌。因为本文重点关注的是酸性电解水处理的水产品在贮藏过程中肠道微生物多样性的变化，所以没有对单一条带进行深入的分析。

酸性电解水的研究主要集中在其高效的杀菌效果，而其在影响水产品品质方面也有相关报道。已有研究表明电解水能够减少冷藏河豚鱼中挥发性盐基氮、pH、硫代巴比妥酸值等品质指标的变化，同时还可以减少河豚鱼肉的硬度、弹性和回复性等质构结果的变化，从而延长了冷藏河豚鱼的货架期[21]。谢军等[22]研究表明电解水浸泡生虾后基本上不影响其感官品质，可以代替自来水用于原料虾的清洗。结合本研究结果表明，酸性电解水具有高效、广谱杀菌的作用且能够显著改变肠道微生物的多样性，为其保障水产品质量安全提供了参考依据以及为探讨酸性电解水延长水产品货架期的机理提供了理论支撑。

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Changes of acidic electrolyzed water on intestinal microflora diversity of Penaeus vannawei during storage

FU Jiao-jiao1，2，3，PENG Zhi-yun1，2，3，LIU Hai-quan1，2，3，SUN Xiao-hong1，2，3，PAN Ying-jie1，2，3，ZHAO Yong1，2，3，*
（1.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2.Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing&Preservation，Shanghai 201306，China；3.Laboratory of Quality Safety Risk Assessment for Aquatic Products on Storage and Preservation（Shanghai），Ministry of Agriculture，Shanghai 201306，China）

Intestinal microflora was considered as one of the major sources to cause the corruption of aquatic products.As a new-type environmental disinfectant，acidic electrolyzed water（AEW）had gradually been applied to control the security of aquatic products，which was receiving more and more attentions due to its efficient broad-spectrum sterilization.In this paper，PCR-DGGE technology was used to analyze the variation of intestinal microflora diversity in Penaeus vannamei stored at 0℃，4℃and 25℃，which were treated by tapwater（TW）and AEW，respectively.Compared with TW group，samples under AEW showed a decreasing diversity of intestinal microflora during storage，which indicated that intestinal microflora diversity was significantly affected by AEW.The results would be used to provide a theoretical reference for the security of aquatic products.

Penaeus vannamei；AEW；intestinal microflora；DGGE

TS254.4

A

1002-0306（2015）04-0344-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.066

2014－05－06

付娇娇（1989-），女，硕士研究生，研究方向：食品预测微生物学及定量风险评估。

赵勇（1975-），男，博士，教授，主要从事食品安全与食品生物技术方面的研究。

国家自然科学基金（31271870）；上海市科学技术委员会部分地方院校能力建设项目（11310501100）；上海市科学技术委员会科技创新行动计划项目（12391901300）；上海市科技兴农重点攻关项目（沪农科攻字2014第3-5号）。